应用CRISPR/Cas9技术定向突变烟草CYP71D16基因的研究
发布时间：2021-11-21 17:24
烟草（Nicotiana tabacum L.）是一种重要的经济作物,在我国种植范围较广。烟草品种是影响烟叶产量和品质的主要因素。目前我国对烟草品种的选育仍停留在以表型选择为主的传统育种模式,这种经验育种方式不仅周期长而且品种改良进度缓慢,难以满足我国的经济发展需求。CRISPR/Cas9技术是继锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）技术之后的一种新的基因组编辑技术,它具有方便、高效、周期短以及载体结构简单等优点,这为改良品种以及提高烟叶品质提供了一条简单有效的基因突变技术手段。为快速获得定向突变材料和提高烟草育种效率,因此,本研究应用CRISPR/Cas9技术构建对烟草CYP71D16基因进行定向突变的重组载体,利用该载体遗传转化烟草K326,采用多种方法对转化株进行筛选及突变鉴定,构建并优化了烟草CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,获得了定向突变烟草CYP71D16基因的突变株。主要研究结果如下:1.CRISPR/Cas9重组载体构建:通过对烟草CYP71D16基因序列分析,在外显子上选择符合要求的靶点（分别记作SG39、SG38）,将靶点与CRISP...
【文章来源】：贵州大学贵州省 211工程院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas9系统的基本结构
图 2-1 农杆菌培养的 6 种平板划线方法Fig. 2-1 Six plate streaking methods in Agrobacterium tumefaciens culture植体侵染及共培养盘转化法进行外植体侵染及共培养。首先，用 10 μl 的枪头挑放入 5 ml YEP 液体培养基，200 rpm，28℃条件下振荡-0.7，将振荡好的菌液转移至 50 ml 离心管中，于 4℃，6000 rp min，收集菌体。然后，取无菌烟草植物叶片，洗涤干净后先用 7 s，接着用 0.1%升汞消毒 7 min，再用无菌水冲洗 3-5 次，切成约备用（注意去掉边缘的叶片）。最后，将收集到的菌体用 MS 将切好的叶片放入重悬菌液中，侵染 6 min，用吸水纸蘸干侵紧密排列于共培养基上，置于 25℃光照下培养。
贵州大学 2019 届硕士研究生毕业论文GGGTTGTTATTAGTTCTCCT，记作 SG39。而第二个靶点不需要改变碱基，从而记作 SG38。CRISPR/Cas9 重组载体的质粒图谱如图 3-1 。两种载体均采用加强型CaMV35 启动子高效表达 Cas9 蛋白，同时采用 CaMV35S 启动子高效表达潮霉素抗性基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术定点敲除烟草多酚氧化酶基因NtPPO1[J]. 姚恒,杨大海,白戈,谢贺. 生物技术通报. 2018(11)
[2]基因编辑新技术最新进展[J]. 张梦娜,柯丽萍,孙玉强. 中国细胞生物学学报. 2018(12)
[3]Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化[J]. 邱实,张文举,许馥慧,邓志瑞. 上海大学学报(自然科学版). 2018(02)
[4]CRISPR/Cas9定点编辑水稻LOCOs05g31750基因位点及靶修饰位点遗传稳定性研究[J]. 沈春修,却志群,刘莹,廖锦风. 核农学报. 2018(06)
[5]利用CRISPR/Cas9技术的烟草NtLS基因敲除分析[J]. 王姗姗,杨军,王中,林福呈,潘婷,武明珠,张剑锋,曹培健,谢小东. 烟草科技. 2018(02)
[6]内质网应激因子NAC089突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应[J]. 焦裕冰,秦元霞,何青云,李方方,申莉莉,杨金广,吴元华. 植物病理学报. 2018(04)
[7]NAA与6-BA对黑金丝柚木组织培养的影响[J]. 李学东,华帅,刘长安. 亚热带植物科学. 2017(04)
[8]NAA、IAA和IBA对红瑞木扦插生根的影响[J]. 刘义,胡大志. 中国林副特产. 2017(05)
[9]基于CRISPR/Cas9技术的水稻转录因子tify1a和tify1b突变体的创建与分析[J]. 黄小贞,曾晓芳,李建容,赵德刚. 农业生物技术学报. 2017(06)
[10]利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术定向敲除烟草eIF4E-6基因[J]. 潘洪杏,刘侠,万秀清,乔婵,宋琳娜,郭兆奎,李若. 分子植物育种. 2017(02)
博士论文
[1]CRISPR/Cas9系统介导的棉花GhCLA1和GhVP基因编辑的研究[D]. 陈修贵.华中农业大学 2017
硕士论文
[1]CRISPR/Cas9编辑NtNINJA基因对低温胁迫下NtJAZ1的表达量的影响[D]. 吕嘉.西南大学 2018
[2]CRISPR/Cas9介导烟草NtBSK3的基因编辑及NtBSK家族生物学效应分析[D]. 郑赛.西南大学 2018
[3]CRISPR/Cas9技术编辑普通烟草NtBRI1基因及其生物学效应研究[D]. 周雪.西南大学 2018
[4]利用CRISPR/Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究[D]. 刘亚娟.内蒙古大学 2017
[5]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创造早熟香味水稻[D]. 周文甲.中国科学院大学(中国科学院东北地理与农业生态研究所) 2017
[6]烟碱去甲基化酶基因的敲除与烟草低害素材创制[D]. 陈晓乐.西南大学 2017
[7]利用CRISPR/Cas9系统定点敲除杨树和烟草PDS基因的研究[D]. 李媛.安徽农业大学 2016
[8]利用CRISPR/Cas9技术定向突变水稻光温敏核不育基因PTGMS2-1的研究[D]. 吴云花.江西农业大学 2016
[9]栽培烟草原生质体培养再生植株的研究和烟草抗病相关基因NtEIF4E与NtTOM3的敲除和鉴定[D]. 熊海军.西南大学 2016
[10]病毒介导CRISPR/Cas9烟草基因编辑系统的研究[D]. 宗渊.青海师范大学 2016
本文编号：3509923
【文章来源】：贵州大学贵州省 211工程院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas9系统的基本结构
图 2-1 农杆菌培养的 6 种平板划线方法Fig. 2-1 Six plate streaking methods in Agrobacterium tumefaciens culture植体侵染及共培养盘转化法进行外植体侵染及共培养。首先，用 10 μl 的枪头挑放入 5 ml YEP 液体培养基，200 rpm，28℃条件下振荡-0.7，将振荡好的菌液转移至 50 ml 离心管中，于 4℃，6000 rp min，收集菌体。然后，取无菌烟草植物叶片，洗涤干净后先用 7 s，接着用 0.1%升汞消毒 7 min，再用无菌水冲洗 3-5 次，切成约备用（注意去掉边缘的叶片）。最后，将收集到的菌体用 MS 将切好的叶片放入重悬菌液中，侵染 6 min，用吸水纸蘸干侵紧密排列于共培养基上，置于 25℃光照下培养。
贵州大学 2019 届硕士研究生毕业论文GGGTTGTTATTAGTTCTCCT，记作 SG39。而第二个靶点不需要改变碱基，从而记作 SG38。CRISPR/Cas9 重组载体的质粒图谱如图 3-1 。两种载体均采用加强型CaMV35 启动子高效表达 Cas9 蛋白，同时采用 CaMV35S 启动子高效表达潮霉素抗性基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术定点敲除烟草多酚氧化酶基因NtPPO1[J]. 姚恒,杨大海,白戈,谢贺. 生物技术通报. 2018(11)
[2]基因编辑新技术最新进展[J]. 张梦娜,柯丽萍,孙玉强. 中国细胞生物学学报. 2018(12)
[3]Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化[J]. 邱实,张文举,许馥慧,邓志瑞. 上海大学学报(自然科学版). 2018(02)
[4]CRISPR/Cas9定点编辑水稻LOCOs05g31750基因位点及靶修饰位点遗传稳定性研究[J]. 沈春修,却志群,刘莹,廖锦风. 核农学报. 2018(06)
[5]利用CRISPR/Cas9技术的烟草NtLS基因敲除分析[J]. 王姗姗,杨军,王中,林福呈,潘婷,武明珠,张剑锋,曹培健,谢小东. 烟草科技. 2018(02)
[6]内质网应激因子NAC089突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应[J]. 焦裕冰,秦元霞,何青云,李方方,申莉莉,杨金广,吴元华. 植物病理学报. 2018(04)
[7]NAA与6-BA对黑金丝柚木组织培养的影响[J]. 李学东,华帅,刘长安. 亚热带植物科学. 2017(04)
[8]NAA、IAA和IBA对红瑞木扦插生根的影响[J]. 刘义,胡大志. 中国林副特产. 2017(05)
[9]基于CRISPR/Cas9技术的水稻转录因子tify1a和tify1b突变体的创建与分析[J]. 黄小贞,曾晓芳,李建容,赵德刚. 农业生物技术学报. 2017(06)
[10]利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术定向敲除烟草eIF4E-6基因[J]. 潘洪杏,刘侠,万秀清,乔婵,宋琳娜,郭兆奎,李若. 分子植物育种. 2017(02)
博士论文
[1]CRISPR/Cas9系统介导的棉花GhCLA1和GhVP基因编辑的研究[D]. 陈修贵.华中农业大学 2017
硕士论文
[1]CRISPR/Cas9编辑NtNINJA基因对低温胁迫下NtJAZ1的表达量的影响[D]. 吕嘉.西南大学 2018
[2]CRISPR/Cas9介导烟草NtBSK3的基因编辑及NtBSK家族生物学效应分析[D]. 郑赛.西南大学 2018
[3]CRISPR/Cas9技术编辑普通烟草NtBRI1基因及其生物学效应研究[D]. 周雪.西南大学 2018
[4]利用CRISPR/Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究[D]. 刘亚娟.内蒙古大学 2017
[5]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创造早熟香味水稻[D]. 周文甲.中国科学院大学(中国科学院东北地理与农业生态研究所) 2017
[6]烟碱去甲基化酶基因的敲除与烟草低害素材创制[D]. 陈晓乐.西南大学 2017
[7]利用CRISPR/Cas9系统定点敲除杨树和烟草PDS基因的研究[D]. 李媛.安徽农业大学 2016
[8]利用CRISPR/Cas9技术定向突变水稻光温敏核不育基因PTGMS2-1的研究[D]. 吴云花.江西农业大学 2016
[9]栽培烟草原生质体培养再生植株的研究和烟草抗病相关基因NtEIF4E与NtTOM3的敲除和鉴定[D]. 熊海军.西南大学 2016
[10]病毒介导CRISPR/Cas9烟草基因编辑系统的研究[D]. 宗渊.青海师范大学 2016
本文编号：3509923
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