蛋白酶抑制子NbSIPI6在植物抗PVY病毒中的作用
发布时间：2021-12-18 16:24
植物病毒病由于严重影响作物正常生长发育,发病后又难以防治,造成巨大经济损失,如何有效防治病毒病一直是制约农业生产的重要问题。病毒在侵染寄主植物后,需利用寄主组分,进行复制和移动,因此如何抑制其复制与移动是防治植物病毒病的两个重要环节。植物蛋白酶抑制子（Plant Protease Inhibitor,PPI）是植物重要的防御组分,调控植物对病、虫与草等的抗性,但PPI对病毒的抗性研究还相对较少。NbSIPI6是一个被胁迫诱导表达的大豆胰蛋白酶抑制子家族成员,实验室前期研究发现烟草NbSIPI6可抑制PVX病毒的长距离移动,增强本氏烟对PVX的抗性。本实验想进一步探究NbSIPI6是否拮抗PVY,以此丰富PPI类基因对抗病毒的认识。本实验利用NbSIPI6融合GFP的转基因材料,分析NbSIPI6本氏烟对PVY病毒的抗性,并为亚细胞定位和后续免疫沉淀提供基础。此外,分析了NbSIPI6响应病毒与水杨酸（Salicylic acid,SA）的表达模式以及NbSIPI6对病毒基因沉默抑制子活性的影响,为探索蛋白酶抑制子在抗病毒中的相关作用机制提供依据。主要研究结果如下:1.构建NbSIPI6...
【文章来源】：浙江师范大学浙江省
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NbSIPI6-GFP-1300与NbSIPI6m-GFP-1300载体PCR验证及酶切验证M:DNAMarker;1-2:NbSIPI6PCR产物；3-4:NbSIPI6mPCR产物;5:NbSIPI6酶切产物；
第二章NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300载体构建及本氏烟遗传转化28图2.3NbSIPI6本氏烟遗传转化过程1.预培养；2.分化；3.生根；4.移栽Fig.2.3TheprocessofAgrobacteriummediatedN.benthamianatransformation1:preconditioning;2:differentiation;3:rooting;4:transplanting12343.3转基因烟草植株鉴定利用农杆菌介导的叶盘法将NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300载体转入本氏烟，经潮霉素(25mg/L)筛选后，获得16个独立株系(表2.2)。表2.2转基因烟草植株统计由于转基因植株存在假阳性可能，因此需对抗性植株进行鉴定。以转基因基因组为模板用GFP引物进行PCR检测，结果在两种基因型的总计10个转基因植株上能扩增出700bp左右目的条带，初步证明目的基因已经整合在本氏烟染色体上(表2.2、图2.4)。获得植株统计潮霉素筛选获得T0代转基因植株数（株）PCR获得T0代转基因植株数（株）获得T0代阳性植株数（株）NbSIPI6超表达533NbSIPI6m超表达1177
第二章NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300载体构建及本氏烟遗传转化29M1234567891011121314151617图2.4转基因植株的PCR检测图M：DNAMarker2000；1-5：NbSIPI6超表达株系；6-16：NbSIPI6超表达突变株系；17：阴性对照；Fig.2.4Detectingofover-expressionlinesbyPCRM:2kbDNAMarker;1-5:PCRproductsofover-expressionNbSIPI6lines;6-16:PCRproductsofover-expressionNbSIPI6mlines;17:wildtype3.4实时定量PCR分析NbSIPI6的表达选取经PCR鉴定的超表达NbSIPI6和NbSIPI6m阳性株系，通过实时定量PCR分析靶标基因NbSIPI6的表达，结果如图2.5所示，阳性株系NbSIPI6表达量与野生型Nb相比有了明显提高，在T0代显示有极显著差异，进一步验证了超表达NbSIPI6株系和超表达NbSIPI6m株系是阳性株系，从阳性株系中分别挑取三个株系，分别为NbSIPI6-GFP-1300-2、NbSIPI6-GFP-1300-4、NbSIPI6-GFP-1300-5和NbSIPI6m-GFP-1300-5、NbSIPI6m-GFP-1300-8、NbSIPI6m-GFP-1300-11。图2.5转基因株系中靶基因的表达Fig.2.5Expressionleveloftargetgeneintransgeniclinesandwildtype
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物病原菌效应因子的毒性功能研究进展[J]. 李金玥. 科教导刊(下旬). 2016(04)
[2]植物抗病毒分子机制[J]. 钱礼超,刘玉乐. 中国科学:生命科学. 2014(10)
[3]植物抗病毒分子机制的研究进展[J]. 孔君,杜智欣,朱水芳,鲁洁. 生物技术通报. 2012(11)
[4]植物病毒适应性机制研究进展[J]. 仵发静,刘雅婷,李晶,郑元仙,陈雪娇,徐烨,智龙. 生物技术通报. 2012(10)
[5]烟草对蚀纹病毒和马铃薯Y病毒的抗病性鉴定[J]. 黄婷,袁治礼,成巨龙,吴云锋,武占敏,代锦. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2012(06)
[6]植物蛋白质的亚细胞定位研究进展[J]. 邢浩然,刘丽娟,刘国振. 华北农学报. 2006(S2)
硕士论文
[1]碱蓬脱水素蛋白（SsDHN）的亚细胞定位及功能研究[D]. 马宝月.沈阳农业大学 2019
[2]辅助成分蛋白酶和柱状内含体蛋白在马铃薯Y病毒病症状形成过程中的作用机制[D]. 栾雅梦.山东农业大学 2019
本文编号：3542759
【文章来源】：浙江师范大学浙江省
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NbSIPI6-GFP-1300与NbSIPI6m-GFP-1300载体PCR验证及酶切验证M:DNAMarker;1-2:NbSIPI6PCR产物；3-4:NbSIPI6mPCR产物;5:NbSIPI6酶切产物；
第二章NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300载体构建及本氏烟遗传转化28图2.3NbSIPI6本氏烟遗传转化过程1.预培养；2.分化；3.生根；4.移栽Fig.2.3TheprocessofAgrobacteriummediatedN.benthamianatransformation1:preconditioning;2:differentiation;3:rooting;4:transplanting12343.3转基因烟草植株鉴定利用农杆菌介导的叶盘法将NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300载体转入本氏烟，经潮霉素(25mg/L)筛选后，获得16个独立株系(表2.2)。表2.2转基因烟草植株统计由于转基因植株存在假阳性可能，因此需对抗性植株进行鉴定。以转基因基因组为模板用GFP引物进行PCR检测，结果在两种基因型的总计10个转基因植株上能扩增出700bp左右目的条带，初步证明目的基因已经整合在本氏烟染色体上(表2.2、图2.4)。获得植株统计潮霉素筛选获得T0代转基因植株数（株）PCR获得T0代转基因植株数（株）获得T0代阳性植株数（株）NbSIPI6超表达533NbSIPI6m超表达1177
第二章NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300载体构建及本氏烟遗传转化29M1234567891011121314151617图2.4转基因植株的PCR检测图M：DNAMarker2000；1-5：NbSIPI6超表达株系；6-16：NbSIPI6超表达突变株系；17：阴性对照；Fig.2.4Detectingofover-expressionlinesbyPCRM:2kbDNAMarker;1-5:PCRproductsofover-expressionNbSIPI6lines;6-16:PCRproductsofover-expressionNbSIPI6mlines;17:wildtype3.4实时定量PCR分析NbSIPI6的表达选取经PCR鉴定的超表达NbSIPI6和NbSIPI6m阳性株系，通过实时定量PCR分析靶标基因NbSIPI6的表达，结果如图2.5所示，阳性株系NbSIPI6表达量与野生型Nb相比有了明显提高，在T0代显示有极显著差异，进一步验证了超表达NbSIPI6株系和超表达NbSIPI6m株系是阳性株系，从阳性株系中分别挑取三个株系，分别为NbSIPI6-GFP-1300-2、NbSIPI6-GFP-1300-4、NbSIPI6-GFP-1300-5和NbSIPI6m-GFP-1300-5、NbSIPI6m-GFP-1300-8、NbSIPI6m-GFP-1300-11。图2.5转基因株系中靶基因的表达Fig.2.5Expressionleveloftargetgeneintransgeniclinesandwildtype
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物病原菌效应因子的毒性功能研究进展[J]. 李金玥. 科教导刊(下旬). 2016(04)
[2]植物抗病毒分子机制[J]. 钱礼超,刘玉乐. 中国科学:生命科学. 2014(10)
[3]植物抗病毒分子机制的研究进展[J]. 孔君,杜智欣,朱水芳,鲁洁. 生物技术通报. 2012(11)
[4]植物病毒适应性机制研究进展[J]. 仵发静,刘雅婷,李晶,郑元仙,陈雪娇,徐烨,智龙. 生物技术通报. 2012(10)
[5]烟草对蚀纹病毒和马铃薯Y病毒的抗病性鉴定[J]. 黄婷,袁治礼,成巨龙,吴云锋,武占敏,代锦. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2012(06)
[6]植物蛋白质的亚细胞定位研究进展[J]. 邢浩然,刘丽娟,刘国振. 华北农学报. 2006(S2)
硕士论文
[1]碱蓬脱水素蛋白（SsDHN）的亚细胞定位及功能研究[D]. 马宝月.沈阳农业大学 2019
[2]辅助成分蛋白酶和柱状内含体蛋白在马铃薯Y病毒病症状形成过程中的作用机制[D]. 栾雅梦.山东农业大学 2019
本文编号：3542759
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3542759.html
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