基于砷响应蛋白ArsR的无细胞砷生物传感器的构建与优化
发布时间：2022-01-04 01:11
砷及其化合物是自然界广泛分布的持久性有毒污染物,砷暴露威胁人类健康。目前的技术无法永久性消除砷污染,因此,砷污染的监测和检测则极为重要。砷污染检测的传统方法依赖于大型的化学分析仪器,费时费力通量低,且需受过训练的专业人员在专门的实验室才能开展。全菌生物传感器是近年发展起来的砷检测新技术,方便、简单且灵敏。但由于细菌细胞壁和细胞膜屏障以及细菌个体代谢反应的干扰等问题,导致检测结果的稳定性较差。为了解决全菌生物传感器的局限性,本研究利用全菌生物传感器的核心遗传编码组件:砷响应操纵子/报告基因,结合体外无细胞蛋白合成技术,构建无细胞砷生物传感器。主要研究成果如下:1、我们从已有的ArsR突变体库中筛选对砷响应灵敏且适于体外表达的突变体,野生型ArsR在体外对于砷响应不明显,筛选出的ep3 ArsR突变体在体外检测对50μg/L浓度的砷有明显响应,GPF荧光表达增强约3.4倍。2、检测到ep3 ArsR和GFP蛋白在体外均有表达,ArsR调控基因调节报告基因GFP的表达。3、研究了无细胞系统的组分提取和反应条件对无细胞砷生物传感器的性能的影响。结果发现最佳检测条件是37℃、pH7.2下平衡30...
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１地下水中含砷的全球预测图［１７］??
?第１章绪论???Ａｒｓｅｎｉｃ??＾?ｙ、一??ＲＡＦ?ＭＫＫ?３／６?ＭＫＫ１－５??士?士?ｉ??ＭＥＫ１／２?ｐ３８ｋｉｎ＜，Ｓｅ?ＭＫ｜４／７??ｉ?＼?１??Ｅ＿?＼?／??Ｊｕｎ?Ｆｏｓ??Ｖ??Ｏ??ＴＵＭＯＵＲＩＧＥＮＥＳＩＳ?ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ??ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ?ＴＵＭＯＵＲ?ＳＵＰＰＲＥＳＳＩＯＮ??ＩＮＦＬＡＭＭＡＴＩＯＮ??图１．７砷介导的细胞信号通路（ＥＧＦＲ，表皮生长因子受体；ＧＰｘ，谷胱甘肽??过氧化物酶；ＴＲＸ，硫氧还蛋白；ＪＮＫ，?ｃ－Ｊｕｎ氨基末端激酶，ＭＫＫ，丝裂原活化??蛋白激酶）［５５］??Ｆｉｇｕｒｅ?１．７?Ａｒｓｅｎｉｃ－ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｃｅｌｌ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?（ＥＧＦＲ，?ｅｐｉｄｅｒｍａｌ?ｇｒｏｗｔｈ?ｆａｃｔｏｒ??ｒｅｃｅｐｔｏｒ；?ＧＰｘ，?ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ?ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；?ＴＲＸ，?ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ；?ＪＮＫ，?ｃ－Ｊｕｎ?Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ??ｋｉｎａｓｅｓ，?ＭＫＫ，?Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｋｉｎａｓｅ?ｋｉｎａｓｅｓ）??１．３砷检测的技术及其原理??１．３．１物理化学检测方法??随着现代科学的发展，利用物理化学技术不断发展砷的不同检测手段，主要??检测方法如下：??原子焚光光谱法（Ａｔｏｍｉｃ?Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ），简称ＡＦＳ，用硝酸和??过氧化氢对于食物或水样中的砷进行微波消解，再利用硼氢化钾将砷还原成砷化??氢，砷原子受阴极灯辐射激发从基态跃迁到激发态，最终再回到基态，不同能级??振动时会产生荧光。荧
?第１章绪论???生改变，从ＤＮＡ结合位点上解离，并启动下游报告基因的转录。随着材料科学的??不断发展和对砷结合机制的理解，己经开发出了很多用于砷测定的新型生物传感??器（如图１．８）。??Ａｒｓｅｎｉｃ??Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ??ｌ??Ｗｈｏｌｅ－ｃｅｉｉ－ｂａｓｅｄ?Ｃｅｉｉ－ｆｒｅｅ＞ｂａｓｅｄ???ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ??ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ??ｒｙ；＂?ｉ?ｉ「．．．．．．．——ｉ?ｒ－．??Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ?ｌａｃＺ?ｇｆｐ?｜?＾ａ＾ｒｏａｃｈｅｓ１６?ＤＮＡ?Ａｐｔａｍｅｒ?Ｐｒｏｔｅｉｎ??图１．８基于生物成分的砷生物传感器分类［７１］??Ｆｉｇｕｒｅ?１．８?Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ?ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｂａｓｅｄ?ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｒｓｅｎｉｃ?ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ??１．３．２．?２全细胞砷生物传感器??全细胞生物传感器是一种以微生物全细胞为敏感元件，可以快速识别待测物??质并转化为可识别信号，从而对于各种分析物进行定性和定量的监测［７６，?７７］。其??主要组分：感应元件和报告元件（图１．９），第一部分调节基因或启动子能够对??分析物或其浓度的变化做出响应，第二部分能够将检测到的化学信号转换成可??检测的报告蛋白信号，通过鉴定报告蛋白的数量和强度作为生物传感器的活性。??节基因／启动子报告基因??卜录?＼??分析物?Ｙ?ＡＡＡＡＡ／?ｍＲＮＡ?Ｉ??＼?１翻译??＼?〇报告蛋白／／＾?????＾?Ｖ?＾??图１．９全细胞生物传感器的示意图??Ｆｉｇｕｒｅ?１．９?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ?ｂ
【参考文献】：
期刊论文
[1]水中重金属砷检测方法的等效的判定[J]. 崔文文,王习著,王小飞,王明锐,易甜,张惠贤,姚晶晶. 绿色科技. 2018(20)
[2]食品中重金属砷的危害及其检测方法[J]. 侯双迪,王鑫,邵娟娟,苑宁,魏月,贾丽娜. 农产品加工. 2017(07)
[3]地下水砷污染研究进展[J]. 金阳,姜月华,李云. 地下水. 2015(01)
[4]电感耦合等离子体质谱法测定水中砷的方法改进[J]. 蒋励,殷忠. 环境卫生学杂志. 2013(04)
[5]液态奶中无机砷的测定[J]. 刘伟娟,吴聪,张均媚,薛刚,李卓,张燕. 食品研究与开发. 2011(03)
[6]误饮工业用水致急性砷中毒事故一起[J]. 彭静,李森林. 中国实用医药. 2009(14)
[7]中国主要含砷矿产资源的区域分布与砷污染问题[J]. 肖细元,陈同斌,廖晓勇,武斌,阎秀兰,翟丽梅,谢华,王莉霞. 地理研究. 2008(01)
[8]土壤中砷污染研究进展[J]. 蒋成爱,吴启堂,陈杖榴. 土壤. 2004(03)
[9]中国地方性砷中毒分布调查(总报告)[J]. 金银龙,梁超轲,何公理,曹静祥,马凤,王汉章,应波,吉荣娣,中国地方性砷中毒分布调查协作组. 卫生研究. 2003(06)
本文编号：3567344
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
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【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１地下水中含砷的全球预测图［１７］??
?第１章绪论???Ａｒｓｅｎｉｃ??＾?ｙ、一??ＲＡＦ?ＭＫＫ?３／６?ＭＫＫ１－５??士?士?ｉ??ＭＥＫ１／２?ｐ３８ｋｉｎ＜，Ｓｅ?ＭＫ｜４／７??ｉ?＼?１??Ｅ＿?＼?／??Ｊｕｎ?Ｆｏｓ??Ｖ??Ｏ??ＴＵＭＯＵＲＩＧＥＮＥＳＩＳ?ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ??ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ?ＴＵＭＯＵＲ?ＳＵＰＰＲＥＳＳＩＯＮ??ＩＮＦＬＡＭＭＡＴＩＯＮ??图１．７砷介导的细胞信号通路（ＥＧＦＲ，表皮生长因子受体；ＧＰｘ，谷胱甘肽??过氧化物酶；ＴＲＸ，硫氧还蛋白；ＪＮＫ，?ｃ－Ｊｕｎ氨基末端激酶，ＭＫＫ，丝裂原活化??蛋白激酶）［５５］??Ｆｉｇｕｒｅ?１．７?Ａｒｓｅｎｉｃ－ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｃｅｌｌ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?（ＥＧＦＲ，?ｅｐｉｄｅｒｍａｌ?ｇｒｏｗｔｈ?ｆａｃｔｏｒ??ｒｅｃｅｐｔｏｒ；?ＧＰｘ，?ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ?ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；?ＴＲＸ，?ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ；?ＪＮＫ，?ｃ－Ｊｕｎ?Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ??ｋｉｎａｓｅｓ，?ＭＫＫ，?Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｋｉｎａｓｅ?ｋｉｎａｓｅｓ）??１．３砷检测的技术及其原理??１．３．１物理化学检测方法??随着现代科学的发展，利用物理化学技术不断发展砷的不同检测手段，主要??检测方法如下：??原子焚光光谱法（Ａｔｏｍｉｃ?Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ），简称ＡＦＳ，用硝酸和??过氧化氢对于食物或水样中的砷进行微波消解，再利用硼氢化钾将砷还原成砷化??氢，砷原子受阴极灯辐射激发从基态跃迁到激发态，最终再回到基态，不同能级??振动时会产生荧光。荧
?第１章绪论???生改变，从ＤＮＡ结合位点上解离，并启动下游报告基因的转录。随着材料科学的??不断发展和对砷结合机制的理解，己经开发出了很多用于砷测定的新型生物传感??器（如图１．８）。??Ａｒｓｅｎｉｃ??Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ??ｌ??Ｗｈｏｌｅ－ｃｅｉｉ－ｂａｓｅｄ?Ｃｅｉｉ－ｆｒｅｅ＞ｂａｓｅｄ???ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ??ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ??ｒｙ；＂?ｉ?ｉ「．．．．．．．——ｉ?ｒ－．??Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ?ｌａｃＺ?ｇｆｐ?｜?＾ａ＾ｒｏａｃｈｅｓ１６?ＤＮＡ?Ａｐｔａｍｅｒ?Ｐｒｏｔｅｉｎ??图１．８基于生物成分的砷生物传感器分类［７１］??Ｆｉｇｕｒｅ?１．８?Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ?ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－ｂａｓｅｄ?ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｒｓｅｎｉｃ?ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ??１．３．２．?２全细胞砷生物传感器??全细胞生物传感器是一种以微生物全细胞为敏感元件，可以快速识别待测物??质并转化为可识别信号，从而对于各种分析物进行定性和定量的监测［７６，?７７］。其??主要组分：感应元件和报告元件（图１．９），第一部分调节基因或启动子能够对??分析物或其浓度的变化做出响应，第二部分能够将检测到的化学信号转换成可??检测的报告蛋白信号，通过鉴定报告蛋白的数量和强度作为生物传感器的活性。??节基因／启动子报告基因??卜录?＼??分析物?Ｙ?ＡＡＡＡＡ／?ｍＲＮＡ?Ｉ??＼?１翻译??＼?〇报告蛋白／／＾?????＾?Ｖ?＾??图１．９全细胞生物传感器的示意图??Ｆｉｇｕｒｅ?１．９?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ?ｂ
【参考文献】：
期刊论文
[1]水中重金属砷检测方法的等效的判定[J]. 崔文文,王习著,王小飞,王明锐,易甜,张惠贤,姚晶晶. 绿色科技. 2018(20)
[2]食品中重金属砷的危害及其检测方法[J]. 侯双迪,王鑫,邵娟娟,苑宁,魏月,贾丽娜. 农产品加工. 2017(07)
[3]地下水砷污染研究进展[J]. 金阳,姜月华,李云. 地下水. 2015(01)
[4]电感耦合等离子体质谱法测定水中砷的方法改进[J]. 蒋励,殷忠. 环境卫生学杂志. 2013(04)
[5]液态奶中无机砷的测定[J]. 刘伟娟,吴聪,张均媚,薛刚,李卓,张燕. 食品研究与开发. 2011(03)
[6]误饮工业用水致急性砷中毒事故一起[J]. 彭静,李森林. 中国实用医药. 2009(14)
[7]中国主要含砷矿产资源的区域分布与砷污染问题[J]. 肖细元,陈同斌,廖晓勇,武斌,阎秀兰,翟丽梅,谢华,王莉霞. 地理研究. 2008(01)
[8]土壤中砷污染研究进展[J]. 蒋成爱,吴启堂,陈杖榴. 土壤. 2004(03)
[9]中国地方性砷中毒分布调查(总报告)[J]. 金银龙,梁超轲,何公理,曹静祥,马凤,王汉章,应波,吉荣娣,中国地方性砷中毒分布调查协作组. 卫生研究. 2003(06)
本文编号：3567344
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