一种植物激素转运蛋白活性检测方法的建立和细胞分裂素转运蛋白生化活性分析
发布时间：2022-01-04 20:20
细胞分裂素（Cytokinins,CKs）是一类调控植物生长发育的重要激素,与叶片衰老、植物抗病及非生物胁迫等均有密切的联系。近年来,CK合成代谢及信号转导的研究已经比较清楚,但是CK转运的分子机制研究尚不够深入。生化活性鉴定是激素转运蛋白研究的难点。AtABCG14是首个被发现的长距离运输CK的半分子转运蛋白,在根部tZ（trans-zeatin,tZ）类CK向地上组织运输过程中发挥重要功能,但AtABCG14生化活性有待深入研究。因此,为了更加简易有效地研究CK转运蛋白的生化活性,以及更加深入的研究AtABCG14的转运活性,我们建立了一种可操作性强且有效的植物激素转运蛋白活性检测方法,并利用该方法检测了AtABCG14转运活性。具体研究结果如下:（1）建立了一种简易有效地研究植物激素转运蛋白活性的方法。建立了烟草瞬时表达系统和液相二级质谱（Liquid Chromatography-Mass/Mass Spectrometry,LC-MS/MS）激素检测方法（烟草-质谱法）,我们利用该方法检测了已报道的ABA外排转运蛋白AtABCG25、JA外排转运蛋白AtABCG16、细胞分裂...
【文章来源】：浙江师范大学浙江省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
在烟草中AtABCG25介导ABA的外排转运
第三章结果与分析44图3.2在烟草中AtABCG16介导JA的外排转运（A）35s::GFP（pMDC43）和35s::GFP-AtABCG16在烟草叶片中的亚细胞定位；Bar=50μm。（B）外排实验前烟草中JA的含量。（C）在0、20、40、60、90min时，对AtABCG16和空载体烟草叶片中外排缓冲液中的JA和（D）ABA（阴性对照）测定。（E）在有无1mM的钒酸钠处理的情况下，60min时烟草叶片中外排样品的JA的比值（GFP-AtABCG16和空载）。数据表示为平均值±SD（n=4），显著性差异（t检验）用*表示：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。Figure3.2AtABCG16mediatedeffluxtransportofJAintobacco.(A)Subcellularlocalizationof35s::GFP(pMDC43)and35s::GFP-AtABCG16intobaccoleaves.Bar=50μm.(B)JAcontentintobaccobeforeefflux.(C)QuantificationofeffluxtransportedJAand(D)ABA(negativecontrol)fromtobaccoleavestransformedwithGFP-AtABCG16oremptyvectoratthetimepointsof0,20,40,60,90min.(E)TheratiosofeffluxtransportedJAfromtobaccoleaves(withGFP-AtABCG16andemptyvectorexpression)inthepresenceorabsenceof1mMsodiumvanadatefor60min.Dataaremeans±SE(n=4).*,**and***indicateP-valuesofP<0.05,P<0.01andP<0.001respectively,fromStudent’st-test.1.3烟草-质谱体系检测AtPUP14活性通过烟草-质谱体系建立的对激素转运蛋白活性检测的方法，通过对AtABCG25和AtABCG16转运活性实验初步证明了该方法的可行性。该方法是否可以用于激素内运蛋白的活性检测，为了证实这一点，我们选取了AtPUP14进行验证，AtPUP14已报到定位于细胞膜上，且通过同位素追踪实验证明其对tZ有向胞内运输的活性[59]。
第三章结果与分析45同AtABCG25和AtABCG16步骤一致，首先在烟叶中瞬时表达GFP-AtPUP14后，通过GFP的亚细胞定位观察（图3.3A）以及和WesternBlot结果（图3.3B），可以确认该蛋白定位于烟草表皮细胞的细胞膜且表达正确。在转运实验前对空载体（freeGFP）和GFP-AtPUP14中细胞分裂素含量检测（图3.3C），叶片中含量较多的tZR和含量较多的tZ均无差异后，进行转运活性实验（图3.2D-H），在0-90min内，尤其是在60-90min内，GFP-AtPUP14比空载体（freeGFP）缓冲液中的tZ含量有所下降，而tZR、iP、iPR和cZR其他细胞分裂素无显著性变化。以上结果表明，用该方法可以证明AtPUP14有向胞内转运tZ的生化活性。图3.3在烟草中AtPUP14介导CK的胞内转运（A）35s::GFP（pMDC43）和35s::GFP-AtPUP14在烟草叶片中的亚细胞定位；Bar=50μm。（B）Westernblotting检测GFP-AtPUP14的电泳图，以35s::GFP为空白对照。（C）外排实验前烟草中tZ和tZR的含量。（D-H）在0、10、20、40、60、90min时，对AtPUP14和空载体的缓冲液中tZ、tZR、iP、iPR和cZR的测定。数据表示为平均值±SD（n=4），显著性差异（t检验）用*表示：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。Figure3.3AtPUP14mediatedinfluxtransportofCKintobacco.(A)Subcellularlocalizationof35s::GFP(pMDC43)and35s::GFP-AtPUP14intobaccoleaves.Bar=50μm.(B)TheelectrophoregramofwesternblottingtodetectGFP-AtPUP14.35s::GFP(pMDC43)expressionwasusedasacontrol.(C)tZandtZRcontentintobaccobeforeefflux.(D-H)QuantificationofinfluxtransportedtZ,tZR,iP,iPRandcZRfromtobaccoleavestransformedwithAtPUP14oremptyvectoratthetimepointsof0,10,20,40,60,90min.Dataaremeans±SE(n=4).*,**and***indicate
本文编号：3568999
【文章来源】：浙江师范大学浙江省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
在烟草中AtABCG25介导ABA的外排转运
第三章结果与分析44图3.2在烟草中AtABCG16介导JA的外排转运（A）35s::GFP（pMDC43）和35s::GFP-AtABCG16在烟草叶片中的亚细胞定位；Bar=50μm。（B）外排实验前烟草中JA的含量。（C）在0、20、40、60、90min时，对AtABCG16和空载体烟草叶片中外排缓冲液中的JA和（D）ABA（阴性对照）测定。（E）在有无1mM的钒酸钠处理的情况下，60min时烟草叶片中外排样品的JA的比值（GFP-AtABCG16和空载）。数据表示为平均值±SD（n=4），显著性差异（t检验）用*表示：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。Figure3.2AtABCG16mediatedeffluxtransportofJAintobacco.(A)Subcellularlocalizationof35s::GFP(pMDC43)and35s::GFP-AtABCG16intobaccoleaves.Bar=50μm.(B)JAcontentintobaccobeforeefflux.(C)QuantificationofeffluxtransportedJAand(D)ABA(negativecontrol)fromtobaccoleavestransformedwithGFP-AtABCG16oremptyvectoratthetimepointsof0,20,40,60,90min.(E)TheratiosofeffluxtransportedJAfromtobaccoleaves(withGFP-AtABCG16andemptyvectorexpression)inthepresenceorabsenceof1mMsodiumvanadatefor60min.Dataaremeans±SE(n=4).*,**and***indicateP-valuesofP<0.05,P<0.01andP<0.001respectively,fromStudent’st-test.1.3烟草-质谱体系检测AtPUP14活性通过烟草-质谱体系建立的对激素转运蛋白活性检测的方法，通过对AtABCG25和AtABCG16转运活性实验初步证明了该方法的可行性。该方法是否可以用于激素内运蛋白的活性检测，为了证实这一点，我们选取了AtPUP14进行验证，AtPUP14已报到定位于细胞膜上，且通过同位素追踪实验证明其对tZ有向胞内运输的活性[59]。
第三章结果与分析45同AtABCG25和AtABCG16步骤一致，首先在烟叶中瞬时表达GFP-AtPUP14后，通过GFP的亚细胞定位观察（图3.3A）以及和WesternBlot结果（图3.3B），可以确认该蛋白定位于烟草表皮细胞的细胞膜且表达正确。在转运实验前对空载体（freeGFP）和GFP-AtPUP14中细胞分裂素含量检测（图3.3C），叶片中含量较多的tZR和含量较多的tZ均无差异后，进行转运活性实验（图3.2D-H），在0-90min内，尤其是在60-90min内，GFP-AtPUP14比空载体（freeGFP）缓冲液中的tZ含量有所下降，而tZR、iP、iPR和cZR其他细胞分裂素无显著性变化。以上结果表明，用该方法可以证明AtPUP14有向胞内转运tZ的生化活性。图3.3在烟草中AtPUP14介导CK的胞内转运（A）35s::GFP（pMDC43）和35s::GFP-AtPUP14在烟草叶片中的亚细胞定位；Bar=50μm。（B）Westernblotting检测GFP-AtPUP14的电泳图，以35s::GFP为空白对照。（C）外排实验前烟草中tZ和tZR的含量。（D-H）在0、10、20、40、60、90min时，对AtPUP14和空载体的缓冲液中tZ、tZR、iP、iPR和cZR的测定。数据表示为平均值±SD（n=4），显著性差异（t检验）用*表示：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。Figure3.3AtPUP14mediatedinfluxtransportofCKintobacco.(A)Subcellularlocalizationof35s::GFP(pMDC43)and35s::GFP-AtPUP14intobaccoleaves.Bar=50μm.(B)TheelectrophoregramofwesternblottingtodetectGFP-AtPUP14.35s::GFP(pMDC43)expressionwasusedasacontrol.(C)tZandtZRcontentintobaccobeforeefflux.(D-H)QuantificationofinfluxtransportedtZ,tZR,iP,iPRandcZRfromtobaccoleavestransformedwithAtPUP14oremptyvectoratthetimepointsof0,10,20,40,60,90min.Dataaremeans±SE(n=4).*,**and***indicate
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