利用CRISPR/Cas9技术研究miR171a及靶基因功能

发布时间：2022-01-06 02:07

　　miRNA是一段长约22 nt的RNA小分子,它可以影响植物多种生理生化功能。STTM技术是研究miRNA功能的方法之一,它虽然可以阻止miRNA的活性,但无法在基因水平对其进行编辑,进而研究单个miRNA的功能。CRISPR/Cas9是近年来发展的可以靶向编辑DNA序列的技术,已广泛应用于多种植物。本项研究中,我们试图在拟南芥中利用CRISPR/Cas9技术建立鉴定miRNA功能的方法和技术体系,在水稻中验证其可行性,并对其靶基因开展进一步研究。首先,分别用STTM与CRISPR/Cas9技术鉴定拟南芥miR171a的功能,发现两种技术都可以使拟南芥miR171a的表达量降低,靶基因SCL22、SCL27的表达量下调,靶基因SCL6的表达量上调,叶绿素、脯氨酸含量下降、生长势和抗旱能力减弱。在使用CRISPR技术敲除miR171a时,获得了单碱基插入的突变,可以在一定程度上影响miR171a的活性,但效率没有STTM高。这说明CRISPR技术验证miR171a的功能是可行的。其次,为明确miR171在水稻中的功能,构建了包含miR171a双靶点靶向miR171a前体的CRISPR载体... 

【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

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图２?ＣＲ丨ＳＰＲ结构??

（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ?ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）指导ＡＧ０１降解耙基因或抑制祀基因翻译??（Ｂｏｈｍｅｒｔ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１４；?Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ，?２００８；李超等，２００９）。而ｍｉＲＮＡ＊—般则被迅速降解。??相关步骤如图３所示。??ｒ?ｃｉ?ｔｓｓｒ??＾?（＇ｐ〇ｎｉ?ｒ＊％ｍ〇?ＳＩ??？?■?ＭＩＲ?？?Ｏｔｆｗｒ?ＴＦ，??Ｗ／Ｒｐｒ〇ｍｏ？ｅｆ?＾??，ＰｈｏｓｐｆＨＭａｇｕｉａＪｉｏｎ?Ｓｐｆｃｏｏ＾＾ｖＭｅｄ??Ｄｉｃｉｎｇ?ｂｏｄｙ??＼?ｆ?／?Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ?ｓｐｉｃ＊ｎ０－?Ｕｎｋｎｏｗｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ??＼???／?ｌｕｎｃ？ｏｏｓ??＇?ＳＥｉ＾?／?＇?：?Ｏ００１?????似１?ｏｉＪ＾ｉｒ０?２．＇°＇ｍａｈｙｔｅｔｏ＇??Ｉ??Ｎｕｃｌｅｕｓ??一＾??Ｃ＞ＷＰｌａＳｍ?Ｃ＿?＇?＂＇Ｓ－－＾ＳＰ９０??〇?？??ＡＧＯｆ?ＡＧ０１?’?ＥＭＡ１??图３?ｍｉｃｒｏＲＮＡ?（ｍｉＲＮＡ）生物发生的主要步骤（Ｙｕ?ｅｔ?ａ丨？，２０１７）??Ｆｉｇ．３?Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｍａｊｏｒ?ｓｔｅｐｓ?ｉｎ?ｍｉｃｒｏＲＮＡ?（ｍｉＲＮＡ）?ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ??１．２．２?ｍｉＲＮＡ的作用机制??ｍｉＲＮＡ作用于ｍＲＮＡ主要通过降解祀基因，抑制耙基因两种方式。不同ｍｉＲＮＡ??作用方式取决于ｍｉＲＮＡ与其靶位点的序列匹配程度。一般来说，ｍｉＲＮＡ与靶ｍＲＮＡ??完全互补或近完全匹配时，会切割降解靶ｍＵＮＡ；两者不完全匹配时，会抑制靶ｍＲＮＡ??翻译。??除了这两种方式

?海南大学硕士学位论文数据处理使用ＩＢＭ?ＳＰＳＳ?２３．０软件，采用单因素ＡＮＯＶＡ分析时，选择Ｔｕｋｅｙ－??方差齐性检验。绘图使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７软件。??２．?１．２实验方法??（１）靶位点的选取??登录?ｍｉＲＢａｓｅ?数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｍｉｍａ＿ｅｎｔｒｖ．ｐｌ７ａｃｃ??＝ＭＩ００００２１４）获得ｚｎ；７？／７／ｆｌ前体序列（基因登录号：ＭＩ００００２１４）及二级结构。将??前体序列放入?ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ?网站（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ??／ＣＲＩＳＰＲ７ＣＲＩＳＰＲ＃）获得靶位点，并从中挑选合适的２个，分别位于ｍｉＲＮＡ的５’的??成熟区ｓｇＲＮＡ－Ａ和茎环序列ｓｇＲＮＡ－Ｂ上（图４）：??Ａ：ＡＧＧＴＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧ，?Ｂ：?ＧＴＡＴＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＧ??５＊?ＡＴ６Ａ６Ａ６ＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＡＴＡＴＴ６ＧＣＣＴＧ６ＴＴＣＡＣＴＣＡ６ＡＴＣＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＣＡＣＧ１Ａ６ＡＴＡＴＡＣＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣ１Ａ６ＡＴＴＡＴＣＴＧＡＴＴ６Ａ６ＣＣＧＣ６ＣＣＡＡ１ＡＴＣＴＣＡ６ＴＡＣＩＣＴＣＴＣ０Ｔ?３＊??（．．．．，．．．．．?????．．．．．．．?．．．．．４????Ｉ??＊???？???Ｉ???１???１—Ｈ?１２３??３？?ＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＡＡＴＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴ６ＣＡＴＣＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＡＴＡＧＡＣＴＡＡＣＴＣ６ＧＣＣＣＧ

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3571505