MNB1蛋白的GNA结构域调节拟南芥镉耐受的分子机制
发布时间：2022-01-11 12:59
前期研究表明在拟南芥中通过增强MAN3基因表达,可以增强甘露聚糖水解酶的活性,使细胞壁中的甘露糖含量增多,从而增强植株对重金属镉的积累和耐受。已有文献报道在辣椒中,MNB1的同源蛋白Ca MBL1的GNA结构域能够与甘露糖特异性结合。拟南芥中MNB1蛋白中同样存在GNA结构域,尚不清楚MNB1蛋白的GNA结构域是否与MAN3介导的甘露糖调节拟南芥镉耐受的分子机制有关。因此本课题在前期研究已证明MNB1参与重金属镉胁迫响应调控基础上,进一步对MNB1蛋白的GNA结构域调节拟南芥镉耐受的分子机制进行研究,获得了如下研究结果。1.为研究MNB1基因是否被镉胁迫诱导,克隆了MNB1启动子并构建了Pro MNB1-GUS转基因植株。GUS染色分析表明,在镉胁迫下,转基因幼苗的根和叶的蓝色明显要比对照深,表明MNB1基因被镉胁迫诱导。2.构建了一系列MNB1蛋白缺失表达载体并进行蛋白原核表达,同时进行甘露糖结合分析。发现只含有GNA结构域的MNB1蛋白能够与甘露糖结合。从生化角度证明表明MNB1蛋白的GNA结构域是MNB1蛋白与甘露糖结合的关键结构域。3.构建了GNA结构域缺失的转基因植株材料MN...
【文章来源】：合肥工业大学安徽省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
拟南芥MNB1同源分析
第三章实验结果与分析433.1.2MNB1的蛋白序列分析通过分析生物信息学相关数据和查阅相关文献，对MNB1的蛋白序列进行分析，结果如图3.2所示，该图为MNB1的cDNA核苷酸序列和推导的编码GNA相关凝集素蛋白的氨基酸序列。其中，上排为cDNA核苷酸，全长1368bp，下排为氨基酸序列，包含455个氨基酸；前端的黄色区域为SP信号肽序列，包含22个氨基酸；带有红色下划线的区域为推定的GNA结构域，位于蛋白序列的第40个氨基酸到第191个氨基酸之间，包含151个氨基酸；红色背景中的序列是推定的N-糖基化，末端的星号代表终止密码子。根据此蛋白序列，我们后续构建了一系列MNB1蛋白GNA结构域缺失相关表达载体。图3.2MNB1编码蛋白的cDNA核苷酸序列和推定的氨基酸序列分析Fig3.2NucleotideanddeducedaminoacidsequencesanalysisofMNB1cDNAencodingprotein.3.2ProMNB1-GUS转基因株系构建及表达分析3.2.1拟南芥MNB1基因启动子的克隆为了进一步证明MNB1响应重金属镉胁迫，我们构建了ProMNB1-GUS转基因株系。首先构建ProMNB1-GUS表达载体。在拟南芥TAIR网站（www.arabidopsis.org）上查询到长度为2008bp的MNB1基因（At1g78830）的启动子序列，作为目的片段，利用Primerpremier5.0软件设计目的片段引物。提
合肥工业大学硕士论文44取野生型植株基因组DNA作为模板进行目的片段克拢克隆结果如图3.3所示，M代表Marker，1代表目的片段，条带大小与所选取的启动子区域长度一致。图3.3MNB1基因启动子克隆Fig3.3CloningofpromoterofMNB1gene3.2.2目的片段与载体的双酶切通过限制性内切酶KpnI/XhoI分别对克隆的目的片段和GUS空载进行双酶切。本实验所用GUS空载为改造后的pART27载体，载体上加入了KpnI及XhoI酶切位点。酶切后进行电泳检测，电泳结果如图3.4A所示，M1代表2kbMarker，1代表酶切后的目的片段，M2代表10kbMarker，2代表酶切后的载体。3.2.3ProMNB1-GUS重组载体的连接转化酶切产物通过胶回收纯化后，通过T4-DNALigase连接目的片段和载体，转化到大肠杆菌，从抗性平板上挑取单菌落，小接于抗性LB液体培养基37℃培养数小时后，进行菌落PCR。鉴定结果如图3.4B所示，M代表Marker，随机选取的12个菌落中，1、4、5、7、8、9、11、12号显示出明亮条带，选取1号和4号进行测序。测序结果表明，克隆获得的序列正是拟南芥MNB1的启动子的目标片段。AB图3.4ProMNB1-GUS重组载体的酶切与大肠杆菌阳性菌株鉴定Fig3.4DigestionofProMNB1-GUSrecombinantvectorandidentificationofE.colipositivestrains
【参考文献】：
期刊论文
[1]重金属危害机制及益生菌清除重金属机制研究进展[J]. 王瑛,林钰清,李爱军,林启豪,薛雪,王洪飞,陈琬颖. 食品与发酵工业. 2020(03)
[2]土壤重金属污染的危害及修复技术研究[J]. 张鑫. 中国资源综合利用. 2019(11)
[3]重金属污染土壤修复植物根际微生态的研究进展[J]. 谢东,李丝雨,何森,潘涛,董伟. 江西理工大学学报. 2019(05)
[4]Physiological changes and expression characteristics of ZIP family genes under zinc def iciency in navel orange（Citrus sinensis）[J]. XING Fei,FU Xing-zheng,WANG Nan-qi,XI Jian-long,HUANG Yi,ZHOU Wei,LING Li-li,PENG Liang-zhi. Journal of Integrative Agriculture. 2016(04)
[5]重金属污染土壤的生物修复技术研究进展[J]. 罗辉,朱易春,冯秀娟. 安徽农业科学. 2015(05)
[6]对加速我国农业机械化发展的思考[J]. 罗锡文. 农业工程. 2011(04)
[7]植物凝集素的功能[J]. 鲍锦库. 生命科学. 2011(06)
[8]镉毒性损伤及其机制的研究进展[J]. 朱善良,陈龙. 生物学教学. 2006(08)
[9]植物对重金属耐性的分子生态机理[J]. 谭万能,李志安,邹碧. 植物生态学报. 2006(04)
[10]土壤中重金属污染现状与防治方法[J]. 郑喜珅,鲁安怀,高翔,赵谨,郑德圣. 土壤与环境. 2002(01)
硕士论文
[1]拟南芥中MYB4-MAN3-Mannose-MNB1信号通路调节镉积累和耐受的分子机理[D]. 严星星.合肥工业大学 2018
本文编号：3582822
【文章来源】：合肥工业大学安徽省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
拟南芥MNB1同源分析
第三章实验结果与分析433.1.2MNB1的蛋白序列分析通过分析生物信息学相关数据和查阅相关文献，对MNB1的蛋白序列进行分析，结果如图3.2所示，该图为MNB1的cDNA核苷酸序列和推导的编码GNA相关凝集素蛋白的氨基酸序列。其中，上排为cDNA核苷酸，全长1368bp，下排为氨基酸序列，包含455个氨基酸；前端的黄色区域为SP信号肽序列，包含22个氨基酸；带有红色下划线的区域为推定的GNA结构域，位于蛋白序列的第40个氨基酸到第191个氨基酸之间，包含151个氨基酸；红色背景中的序列是推定的N-糖基化，末端的星号代表终止密码子。根据此蛋白序列，我们后续构建了一系列MNB1蛋白GNA结构域缺失相关表达载体。图3.2MNB1编码蛋白的cDNA核苷酸序列和推定的氨基酸序列分析Fig3.2NucleotideanddeducedaminoacidsequencesanalysisofMNB1cDNAencodingprotein.3.2ProMNB1-GUS转基因株系构建及表达分析3.2.1拟南芥MNB1基因启动子的克隆为了进一步证明MNB1响应重金属镉胁迫，我们构建了ProMNB1-GUS转基因株系。首先构建ProMNB1-GUS表达载体。在拟南芥TAIR网站（www.arabidopsis.org）上查询到长度为2008bp的MNB1基因（At1g78830）的启动子序列，作为目的片段，利用Primerpremier5.0软件设计目的片段引物。提
合肥工业大学硕士论文44取野生型植株基因组DNA作为模板进行目的片段克拢克隆结果如图3.3所示，M代表Marker，1代表目的片段，条带大小与所选取的启动子区域长度一致。图3.3MNB1基因启动子克隆Fig3.3CloningofpromoterofMNB1gene3.2.2目的片段与载体的双酶切通过限制性内切酶KpnI/XhoI分别对克隆的目的片段和GUS空载进行双酶切。本实验所用GUS空载为改造后的pART27载体，载体上加入了KpnI及XhoI酶切位点。酶切后进行电泳检测，电泳结果如图3.4A所示，M1代表2kbMarker，1代表酶切后的目的片段，M2代表10kbMarker，2代表酶切后的载体。3.2.3ProMNB1-GUS重组载体的连接转化酶切产物通过胶回收纯化后，通过T4-DNALigase连接目的片段和载体，转化到大肠杆菌，从抗性平板上挑取单菌落，小接于抗性LB液体培养基37℃培养数小时后，进行菌落PCR。鉴定结果如图3.4B所示，M代表Marker，随机选取的12个菌落中，1、4、5、7、8、9、11、12号显示出明亮条带，选取1号和4号进行测序。测序结果表明，克隆获得的序列正是拟南芥MNB1的启动子的目标片段。AB图3.4ProMNB1-GUS重组载体的酶切与大肠杆菌阳性菌株鉴定Fig3.4DigestionofProMNB1-GUSrecombinantvectorandidentificationofE.colipositivestrains
【参考文献】：
期刊论文
[1]重金属危害机制及益生菌清除重金属机制研究进展[J]. 王瑛,林钰清,李爱军,林启豪,薛雪,王洪飞,陈琬颖. 食品与发酵工业. 2020(03)
[2]土壤重金属污染的危害及修复技术研究[J]. 张鑫. 中国资源综合利用. 2019(11)
[3]重金属污染土壤修复植物根际微生态的研究进展[J]. 谢东,李丝雨,何森,潘涛,董伟. 江西理工大学学报. 2019(05)
[4]Physiological changes and expression characteristics of ZIP family genes under zinc def iciency in navel orange（Citrus sinensis）[J]. XING Fei,FU Xing-zheng,WANG Nan-qi,XI Jian-long,HUANG Yi,ZHOU Wei,LING Li-li,PENG Liang-zhi. Journal of Integrative Agriculture. 2016(04)
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[8]镉毒性损伤及其机制的研究进展[J]. 朱善良,陈龙. 生物学教学. 2006(08)
[9]植物对重金属耐性的分子生态机理[J]. 谭万能,李志安,邹碧. 植物生态学报. 2006(04)
[10]土壤中重金属污染现状与防治方法[J]. 郑喜珅,鲁安怀,高翔,赵谨,郑德圣. 土壤与环境. 2002(01)
硕士论文
[1]拟南芥中MYB4-MAN3-Mannose-MNB1信号通路调节镉积累和耐受的分子机理[D]. 严星星.合肥工业大学 2018
本文编号：3582822
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