非天然氨基酸调控的重组寨卡病毒的构建与鉴定
发布时间：2022-01-11 14:43
遗传密码子拓展系统目前主要应用于生命系统蛋白质的标记和修饰,能够与反向遗传学技术相结合,通过将终止密码子UAG变为有义密码子,将非天然氨基酸（unnatural amino acids,UAAs）靶向引入到蛋白质的特定位点,实现非天然氨基酸对病毒表型的靶向控制。目前,遗传密码子拓展系统已成功应用于丁型肝炎病毒（HDV）、腺病毒、人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和流感病毒等,实现了非天然氨基酸对病毒颗粒的表面修饰以及对病毒复制和感染的调控。通过将遗传密码子拓展系统与反向遗传学技术相结合并扩展应用于重要的人类病原体,可以实现非天然氨基酸对病毒复制和感染的系统调控,将为其遗传改造、致病机制研究和疫苗设计提供重要的思路。寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）属于黄病毒科黄病毒属,为单股正链RNA病毒,主要依靠蚊虫传播,自暴发流行以来引起了全世界的广泛关注。寨卡病毒与黄热病毒（yellow fever virus,YFV）、西尼罗病毒（West Nile virus,WNV）、登革病毒（dengue virus,DENV）、乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis viru...
【文章来源】：安徽医科大学安徽省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
特异性的引入非天然氨基酸
安徽医科大学硕士学位论文13非洲和亚洲狭窄的赤道地区。1966年，第一个在非洲以外分离的寨卡病毒株是从马来西亚的埃及伊蚊中分离获得[23]。2007年以前，寨卡病毒仅在亚洲和非洲有散发的病例报道，且没有引起可察觉的暴发和严重的人类疾病[24]。此后，在西太平洋地区的密克罗尼西亚雅浦岛，首次暴发了大规模的寨卡疫情，寨卡病毒感染了全岛四分之三的居民[25]。接着寨卡病毒又在东南亚的一些国家出现了散发病例。2013-2014年，寨卡病毒在法属波利尼西亚和南太平洋等其他地区发生了大流行，并于2014年扩散至美洲，造成超过70万例本地感染[26,27]。2015年寨卡病毒在巴西大暴发，并迅速扩散至其他国家，最后波及全球80多个国家和地区[28]（图2）。更重要的是，随着寨卡病毒的大范围流行，发现其感染可导致格林巴利综合征（Guillain-Barrésyndrome，GBS）、新生儿小头症等严重疾病，引起了全世界的广泛关注[29-31]。2016年2月1日，WHO宣布可能与寨卡病毒感染相关的小头畸形和其他神经系统疾病聚集性病例构成国际关注突发公共卫生事件[32]。目前，针对寨卡病毒感染尚无获批的临床疫苗，且缺乏有效的治疗手段[33]。因此,研制寨卡疫苗的需求十分迫切。图22007-2016年寨卡病毒的暴发[28]Figure2Zikavirusoutbreaksfrom2007-2016[28]
安徽医科大学硕士学位论文172.2.3.1引物设计以寨卡病毒分离株FSS13025的全长感染性克隆基因组序列为模板，根据NEB的Q5点突变试剂盒（Q5Site-DirectedMutagenesisKit）要求以及突变位点的位置，在NEB的网站上使用NEBaseChangerTM在线设计软件，设计相应的突变引物（Table1）。突变质粒构建示意图如图1所示。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如Table1所示。图1-1携带琥珀终止密码子的寨卡病毒全长感染性克隆的构建Figure1-1ConstructionoftheZIKVfμLl-lengthcDNAclonewiththemutationofamberterminalcodon表1-2寨卡病毒琥珀终止密码子的突变引物Table1-2PrimersusedtomutantamberterminalcodonofZIKV引物名称引物序列（5’-3’）退火温度FSS-NS5-22FGATGTCGGCCtagGAGTTCTACTCCTACAAAAAG68℃FSS-NS5-22RTGGTTCAGGCGGGCCTTC71℃FSS-NS5-108FAAAAGGAGGCtagGGTCATGAAGAAC58℃FSS-NS5-108RGTGTATCCTTTCACTTCTTG58℃FSS-NS5-153FGTCATCATCTtagCCTGAAGTGGAAGAAG56℃FSS-NS5-153RTCACCTATATCACACAGC58℃FSS-NS5-246FGCGCATGGACtagCCCAGGAGGC67℃FSS-NS5-246RCCCAAAAGGAGCTGGCTC66℃FSS-NS5-268FGGCTGTGGTAtagTGCGCTGAAGCTCCCAACATGAAGATC70℃
本文编号：3582960
【文章来源】：安徽医科大学安徽省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
特异性的引入非天然氨基酸
安徽医科大学硕士学位论文13非洲和亚洲狭窄的赤道地区。1966年，第一个在非洲以外分离的寨卡病毒株是从马来西亚的埃及伊蚊中分离获得[23]。2007年以前，寨卡病毒仅在亚洲和非洲有散发的病例报道，且没有引起可察觉的暴发和严重的人类疾病[24]。此后，在西太平洋地区的密克罗尼西亚雅浦岛，首次暴发了大规模的寨卡疫情，寨卡病毒感染了全岛四分之三的居民[25]。接着寨卡病毒又在东南亚的一些国家出现了散发病例。2013-2014年，寨卡病毒在法属波利尼西亚和南太平洋等其他地区发生了大流行，并于2014年扩散至美洲，造成超过70万例本地感染[26,27]。2015年寨卡病毒在巴西大暴发，并迅速扩散至其他国家，最后波及全球80多个国家和地区[28]（图2）。更重要的是，随着寨卡病毒的大范围流行，发现其感染可导致格林巴利综合征（Guillain-Barrésyndrome，GBS）、新生儿小头症等严重疾病，引起了全世界的广泛关注[29-31]。2016年2月1日，WHO宣布可能与寨卡病毒感染相关的小头畸形和其他神经系统疾病聚集性病例构成国际关注突发公共卫生事件[32]。目前，针对寨卡病毒感染尚无获批的临床疫苗，且缺乏有效的治疗手段[33]。因此,研制寨卡疫苗的需求十分迫切。图22007-2016年寨卡病毒的暴发[28]Figure2Zikavirusoutbreaksfrom2007-2016[28]
安徽医科大学硕士学位论文172.2.3.1引物设计以寨卡病毒分离株FSS13025的全长感染性克隆基因组序列为模板，根据NEB的Q5点突变试剂盒（Q5Site-DirectedMutagenesisKit）要求以及突变位点的位置，在NEB的网站上使用NEBaseChangerTM在线设计软件，设计相应的突变引物（Table1）。突变质粒构建示意图如图1所示。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如Table1所示。图1-1携带琥珀终止密码子的寨卡病毒全长感染性克隆的构建Figure1-1ConstructionoftheZIKVfμLl-lengthcDNAclonewiththemutationofamberterminalcodon表1-2寨卡病毒琥珀终止密码子的突变引物Table1-2PrimersusedtomutantamberterminalcodonofZIKV引物名称引物序列（5’-3’）退火温度FSS-NS5-22FGATGTCGGCCtagGAGTTCTACTCCTACAAAAAG68℃FSS-NS5-22RTGGTTCAGGCGGGCCTTC71℃FSS-NS5-108FAAAAGGAGGCtagGGTCATGAAGAAC58℃FSS-NS5-108RGTGTATCCTTTCACTTCTTG58℃FSS-NS5-153FGTCATCATCTtagCCTGAAGTGGAAGAAG56℃FSS-NS5-153RTCACCTATATCACACAGC58℃FSS-NS5-246FGCGCATGGACtagCCCAGGAGGC67℃FSS-NS5-246RCCCAAAAGGAGCTGGCTC66℃FSS-NS5-268FGGCTGTGGTAtagTGCGCTGAAGCTCCCAACATGAAGATC70℃
本文编号：3582960
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