基于易错PCR的β-甘露聚糖酶体外分子定向进化研究

发布时间：2022-07-04 21:39

　　采用易错PCR方法,对β-甘露聚糖酶进行体外分子定向进化,通过调整dNTP比例和加入不同浓度的Mn2+,向β-甘露聚糖酶中随机引入突变,构建突变文库,并对筛选得到的突变菌株的突变酶酶学性质进行研究.结果表明:在突变文库的构建过程中,当Mn2+浓度为0.01 mmol/L时,阳性转化率最高,达到80%,氨基酸的突变个数为2.0个,符合易错PCR突变文库的构建原则;经过两轮易错PCR构建的突变文库库容量约为4000,从中筛选出的突变毕赤酵母菌X-33/p GAPZαA-GwMan26A-27的突变酶GwMan26A-27具有耐酸、耐高温且酶活力较高的特性;与突变前相比,GwMan26A-27具有较宽的酶促反应温度范围和适宜pH值范围,热稳定性和p H稳定性均有较大提升;在胃蛋白酶液和胰蛋白酶液中水浴2 h,GwMan26A-27的消化酶稳定性较突变前也均有所提升. 

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
0 引言
1 材料与方法
    1.1 菌株和质粒
    1.2 主要试剂
    1.3 培养基
    1.4 仪器与设备
    1.5 实验方法
        1.5.1 易错PCR引物的设计方法
        1.5.2 易错PCR扩增方法
        1.5.3 易错PCR突变文库的构建方法
        1.5.4 重组子的鉴定方法
        1.5.5 易错PCR突变文库的筛选方法
            1.5.5. 1 突变酶的初筛
            1.5.5. 2 突变酶的复筛
        1.5.6 突变酶酶学性质的研究方法
            1.5.6. 1 温度和pH值对突变酶酶活力的影响
            1.5.6. 2 突变酶的热稳定性和pH稳定性
            1.5.6. 3 消化酶对突变酶酶活力的影响
2 结果与分析
    2.1 易错PCR突变文库的构建结果分析
        2.1.1 易错PCR条件的确立
        2.1.2 易错PCR突变文库的建立
    2.2 易错PCR突变文库的筛选结果分析
    2.3 突变酶酶学性质的研究结果分析
        2.3.1 温度和pH值对突变酶酶活力的影响结果分析
        2.3.2 突变酶的热稳定性和pH稳定性结果分析
        2.3.3 消化酶对突变酶活力的影响结果分析
3 结论


【参考文献】：
期刊论文
[1]耐高温β-甘露聚糖酶毕赤酵母菌M27-8发酵条件优化[J]. 熊进,黄魁英,夏枫耿,陈舒洁,胡海艳.  中国饲料. 2017(19)



本文编号：3655973