耐辐射异常球菌非编码RNA OsiR参与氧化胁迫反应的调控机制
发布时间：2022-08-08 13:21
氧化胁迫产生的活性氧自由基能造成蛋白质、脂质及DNA等生物大分子的氧化损伤。氧保护系统（如过氧化氢酶KatE）在清除活性氧自由基,保护细胞免受氧化损伤的过程中发挥重要作用,但其表达调控机制尚不清楚。研究表明细菌非编码RNA（ncRNAs）广泛参与各种逆境胁迫反应,但在具有超强氧化胁迫抗性的耐辐射异常球菌中,其ncRNAs是否参与氧保护系统介导的氧化胁迫反应调控报道甚少。本研究从耐辐射异常球菌中鉴定了一个特异响应氧化胁迫信号的ncRNA,将其命名为OsiR（Oxidative stress induced regulatory RNA）。围绕OsiR的功能及其在氧化胁迫反应中的作用机制开展研究,取得的主要研究结果如下:1.序列比对分析表明,OsiR是一个Deinococcus属特有的非编码RNA。5’RACE实验结果表明,osiR在I号染色体上反向转录,转录起始于第1,029,200位的腺嘌呤（A）。Northern blot和qRT-PCR结果表明,osiR在氧化胁迫（H2O2）条件下显著诱导表达。启动子调控元件预测和qRT-PCR结果表明,...
【文章页数】：133 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 细菌非编码RNA研究进展
1.1.1 细菌ncRNAs的发现及鉴定
1.1.2 细菌ncRNAs的分类
1.1.3 细菌ncRNAs调控作用的分子机制
1.1.4 细菌ncRNAs的调控特性
1.1.5 细菌ncRNAs参与的代谢调控
1.1.6 ncRNA/mRNA互作的结果
1.1.7 分子伴侣蛋白Hfq在 ncRNAs调控机制中的作用
1.2 耐辐射异常球菌ncRNAs的研究现状
1.3 耐辐射异常球菌的氧化胁迫抗性机制研究进展
1.3.1 耐辐射异常球菌的抗氧化系统
1.3.2 耐辐射异常球菌中抗氧化系统的调节因子
1.4 立题依据和研究意义
1.5 技术路线
第二章 耐辐射异常球菌ncRNA OsiR的序列特征与表达分析
2.1 实验材料
2.1.1 菌株
2.1.2 培养基
2.1.3 酶、试剂盒和化学试剂
2.1.4 Northern blot试剂配制
2.1.5 主要仪器
2.1.6 主要的生物软件
2.1.7 本章节所使用的引物序列
2.2 实验方法
2.2.1 菌株培养条件
2.2.2 耐辐射异常球菌总RNA的提取方法
2.2.3 RNA反转录及实时荧光定量PCR
2.2.4 Northern blot
2.2.5 5'RACE
2.3 结果分析
2.3.1 osiR在基因组中的位置及进化分析
2.3.2 OsiR的结构特征
2.3.3 osiR转录起始位点的确定
2.3.4 osiR在各种逆境胁迫下的表达
2.3.5 osiR的转录调控
2.4 讨论
第三章 OsiR的功能鉴定
3.1 实验材料
3.1.1 菌株
3.1.2 培养基
3.1.3 酶、化学试剂、试剂盒与仪器
3.2 方法
3.2.1 引物设计及融合PCR反应
3.2.2 酶切反应、连接及转化实验
3.2.3 细菌质粒的提取
3.2.4 耐辐射异常球菌基因组DNA的提取
3.2.5 过氧化氢冲击实验
3.2.6 过氧化氢酶活测定
3.2.7 细菌总抗氧化能力测定
3.2.8 耐辐射异常球菌感受态细胞的制备及DNA转化方法
3.2.9 耐辐射异常球菌生长曲线的测定
3.3 结果与分析
3.3.1 osiR缺失突变株、回补株和过表达菌株的构建及验证
3.3.2 不同菌株生长曲线的测定
3.3.3 osiR的缺失对菌株氧化胁迫抗性的影响
3.3.4 osiR的缺失对菌株总抗氧化能力和过氧化氢酶活的影响
3.3.5 osiR的缺失对抗氧化酶基因表达的影响
3.4 讨论
第四章 OsiR与靶标基因katE2 的互作机制研究
4.1 实验材料
4.1.1 菌株
4.1.2 培养基
4.1.3 酶、化学试剂、试剂盒与仪器
4.2 实验方法
4.2.1 mRNA半衰期测定实验
4.2.2 微量热泳动实验
4.3 结果与分析
4.3.1 OsiR与 katE2 mRNA互作位点的分析
4.3.2 osiR的缺失和过表达对katE2 表达量的影响
4.3.3 osiR的缺失对katE2 mRNA半衰期和Kat E2 蛋白表达水平的影响
4.3.4 katE2的缺失对菌株氧化胁迫抗性的影响
4.3.5 OsiR与 katE2 mRNA互作位点的突变对菌株氧化胁迫抗性的影响
4.4 讨论
第五章 OsiR与靶标基因trmE的互作机制研究
5.1 实验材料
5.2 实验方法
5.3 结果与分析
5.3.1 耐辐射异常球菌trmE基因的生物信息学分析
5.3.2 MST验证OsiR与trmE mRNA的互作
5.3.3 osiR的缺失对trmE表达的影响
5.3.4 trmE突变株、回补株和过表达株的构建及验证
5.3.5 trmE的缺失对菌株氧化胁迫抗性的影响
5.4 讨论
第六章 氧化胁迫条件下耐辐射异常球菌转录组和蛋白组分析
6.1 实验材料
6.2 实验方法
6.2.1 氧化胁迫处理方法
6.2.2 细菌总RNA提取方法
6.2.3 RNA-Seq测序流程
6.2.4 RNA-Seq数据分析流程
6.2.5 细菌蛋白质的提取和消化
6.2.6 LC-MS/MS分析及数据采集
6.2.7 蛋白组GO和 KEGG富集分析
6.2.8 蛋白-蛋白互作预测
6.3 结果与分析
6.3.1 RNA-Seq测序数据的概况
6.3.2 差异表达基因的总体分析
6.3.3 正常生长和氧化胁迫条件下差异表达基因的GO和 KEGG分析
6.3.4 野生型菌株和突变株ΔosiR中差异表达基因的GO和 KEGG分析
6.3.5 不同时间氧化胁迫对耐辐射异常球菌基因表达的影响
6.3.6 氧化胁迫条件下OsiR对耐辐射异常球菌基因表达的影响
6.3.7 正常生长和氧化胁迫条件下的差异表达蛋白
6.3.8 差异表达蛋白的GO、KEGG和 COG分析
6.3.9 差异表达蛋白的PPI网络分析
6.3.10 氧化胁迫对耐辐射异常球菌蛋白表达的影响
6.4 讨论
第七章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3671582
【文章页数】：133 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 细菌非编码RNA研究进展
1.1.1 细菌ncRNAs的发现及鉴定
1.1.2 细菌ncRNAs的分类
1.1.3 细菌ncRNAs调控作用的分子机制
1.1.4 细菌ncRNAs的调控特性
1.1.5 细菌ncRNAs参与的代谢调控
1.1.6 ncRNA/mRNA互作的结果
1.1.7 分子伴侣蛋白Hfq在 ncRNAs调控机制中的作用
1.2 耐辐射异常球菌ncRNAs的研究现状
1.3 耐辐射异常球菌的氧化胁迫抗性机制研究进展
1.3.1 耐辐射异常球菌的抗氧化系统
1.3.2 耐辐射异常球菌中抗氧化系统的调节因子
1.4 立题依据和研究意义
1.5 技术路线
第二章 耐辐射异常球菌ncRNA OsiR的序列特征与表达分析
2.1 实验材料
2.1.1 菌株
2.1.2 培养基
2.1.3 酶、试剂盒和化学试剂
2.1.4 Northern blot试剂配制
2.1.5 主要仪器
2.1.6 主要的生物软件
2.1.7 本章节所使用的引物序列
2.2 实验方法
2.2.1 菌株培养条件
2.2.2 耐辐射异常球菌总RNA的提取方法
2.2.3 RNA反转录及实时荧光定量PCR
2.2.4 Northern blot
2.2.5 5'RACE
2.3 结果分析
2.3.1 osiR在基因组中的位置及进化分析
2.3.2 OsiR的结构特征
2.3.3 osiR转录起始位点的确定
2.3.4 osiR在各种逆境胁迫下的表达
2.3.5 osiR的转录调控
2.4 讨论
第三章 OsiR的功能鉴定
3.1 实验材料
3.1.1 菌株
3.1.2 培养基
3.1.3 酶、化学试剂、试剂盒与仪器
3.2 方法
3.2.1 引物设计及融合PCR反应
3.2.2 酶切反应、连接及转化实验
3.2.3 细菌质粒的提取
3.2.4 耐辐射异常球菌基因组DNA的提取
3.2.5 过氧化氢冲击实验
3.2.6 过氧化氢酶活测定
3.2.7 细菌总抗氧化能力测定
3.2.8 耐辐射异常球菌感受态细胞的制备及DNA转化方法
3.2.9 耐辐射异常球菌生长曲线的测定
3.3 结果与分析
3.3.1 osiR缺失突变株、回补株和过表达菌株的构建及验证
3.3.2 不同菌株生长曲线的测定
3.3.3 osiR的缺失对菌株氧化胁迫抗性的影响
3.3.4 osiR的缺失对菌株总抗氧化能力和过氧化氢酶活的影响
3.3.5 osiR的缺失对抗氧化酶基因表达的影响
3.4 讨论
第四章 OsiR与靶标基因katE2 的互作机制研究
4.1 实验材料
4.1.1 菌株
4.1.2 培养基
4.1.3 酶、化学试剂、试剂盒与仪器
4.2 实验方法
4.2.1 mRNA半衰期测定实验
4.2.2 微量热泳动实验
4.3 结果与分析
4.3.1 OsiR与 katE2 mRNA互作位点的分析
4.3.2 osiR的缺失和过表达对katE2 表达量的影响
4.3.3 osiR的缺失对katE2 mRNA半衰期和Kat E2 蛋白表达水平的影响
4.3.4 katE2的缺失对菌株氧化胁迫抗性的影响
4.3.5 OsiR与 katE2 mRNA互作位点的突变对菌株氧化胁迫抗性的影响
4.4 讨论
第五章 OsiR与靶标基因trmE的互作机制研究
5.1 实验材料
5.2 实验方法
5.3 结果与分析
5.3.1 耐辐射异常球菌trmE基因的生物信息学分析
5.3.2 MST验证OsiR与trmE mRNA的互作
5.3.3 osiR的缺失对trmE表达的影响
5.3.4 trmE突变株、回补株和过表达株的构建及验证
5.3.5 trmE的缺失对菌株氧化胁迫抗性的影响
5.4 讨论
第六章 氧化胁迫条件下耐辐射异常球菌转录组和蛋白组分析
6.1 实验材料
6.2 实验方法
6.2.1 氧化胁迫处理方法
6.2.2 细菌总RNA提取方法
6.2.3 RNA-Seq测序流程
6.2.4 RNA-Seq数据分析流程
6.2.5 细菌蛋白质的提取和消化
6.2.6 LC-MS/MS分析及数据采集
6.2.7 蛋白组GO和 KEGG富集分析
6.2.8 蛋白-蛋白互作预测
6.3 结果与分析
6.3.1 RNA-Seq测序数据的概况
6.3.2 差异表达基因的总体分析
6.3.3 正常生长和氧化胁迫条件下差异表达基因的GO和 KEGG分析
6.3.4 野生型菌株和突变株ΔosiR中差异表达基因的GO和 KEGG分析
6.3.5 不同时间氧化胁迫对耐辐射异常球菌基因表达的影响
6.3.6 氧化胁迫条件下OsiR对耐辐射异常球菌基因表达的影响
6.3.7 正常生长和氧化胁迫条件下的差异表达蛋白
6.3.8 差异表达蛋白的GO、KEGG和 COG分析
6.3.9 差异表达蛋白的PPI网络分析
6.3.10 氧化胁迫对耐辐射异常球菌蛋白表达的影响
6.4 讨论
第七章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3671582
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3671582.html
教材专著
