利用DNA同源重组工程和CRISPR/Cas9构建SCN9A人源化小鼠
发布时间：2022-08-23 14:56
随着Nav1.7成为治疗疼痛而无副作用的新靶点,开发出该钠离子通道特异性的镇痛药成为许多制药企业的研究热点。小鼠基因组与人类基因组具有较高的同源性,因此,小鼠一直是人类疾病治疗药物临床前研究阶段主要的动物模型之一。但由于人源和鼠源蛋白之间存在种属差异,会使试验结果之间产生数据偏差,导致许多药物在进入临床研究阶段后,面临很高的失败风险。人SCN9A基因编码Nav1.7的功能性亚基,研发以Nav1.7为靶标的镇痛药物,亟需SCN9A人源化小鼠的构建。人SCN9A基因约180 kb,人类基因组细菌人工染色体（BAC）文库中没有单一的BAC将其完全涵盖,具有完整基因BAC载体的缝合成为SCN9A人源化小鼠构建的前提。本文利用DNA同源重组工程进行人SCN9A基因的缝合,获得了一个308 kb的BAC,同时将Sleeping Beauty（SB）转座酶识别的反向重复序列（IRs）添加至这个BAC载体的两侧,使得该超大BAC转基因载体在进行转座时,不会转座BAC载体的序列。在进行BAC修饰时,将Venus荧光蛋白与人SCN9A蛋白用2A自剪切多肽序列相连,作为报告基因,可以示踪人SCN9A蛋白在小...
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一章 绪论
1.1 DNA同源重组工程
1.1.1 DNA同源重组工程简介
1.1.2 DNA同源重组工程原理
1.1.3 DNA同源重组工程的应用
1.2 SCN9A与Na_v1.7
1.2.1 SCN9A与Na_v1.7简介
1.2.2 SCN9A与神经性疼痛病
1.2.3 以Na_v1.7为靶点的镇痛药物的研究与开发
1.3 人工核酸内切酶介导的基因编辑技术
1.3.1 锌指核酸酶(ZFNs)
1.3.2 转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)
1.3.3 由RNA指导的Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)
1.4 立题依据和意义
1.5 技术路线
第二章 人SCN9A基因的BAC缝合
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 培养基、抗生素和诱导剂
2.1.3 重组引物及测序引物
2.1.4 化学试剂
2.1.5 仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌质粒的小量提取与大量提取
2.2.2 酶切鉴定
2.2.3 聚合酶链式反应
2.2.4 DNA的苯酚/氯仿/异戊醇抽提与酒精沉淀
2.2.5 大肠杆菌的电转方法
2.2.6 在GB05-dir中进行线性DNA之间的重组
2.2.7 在GB08-red中进行线性DNA和环形DNA之间的重组
2.3 实验过程及结果分析
2.3.1 BACAlRP11-746P5的修饰
2.3.2 G856D和A1632E点突变
2.3.3 BAC b1 CH17-291A18的修饰
2.3.4 BAC缝合
2.3.5 BAC缝合后修饰
2.4 讨论
第三章 SCN9A人源化小鼠胚胎干细胞的构建
3.1 实验材料
3.1.1 细胞系和质粒
3.1.2 培养基和抗生素
3.1.3 检测引物
3.1.4 化学试剂
3.1.5 仪器设备
3.2 实验方法
3.2.1 脂质体转染
3.2.2 单克隆的挑取
3.2.3 细胞基因组DNA96孔板提取方法
3.3 实验过程及结果分析
3.4 讨论
第四章 Scn9a基因敲除小鼠胚胎干细胞的构建
4.1 实验材料
4.1.1 质粒
4.1.2 重组引物及测序引物
4.2 实验方法
4.2.1 小鼠胚胎干细胞基因打靶的核转染方法
4.2.2 细胞基因组DNA 24孔板提取方法
4.2.3 ExoCET技术
4.3 实验过程及结果分析
4.3.1 gRNA表达质粒的构建
4.3.2 基因打靶载体的构建
4.3.3 基因打靶及基因型分析
4.4 讨论
第五章 全文总结与展望
附图一: 本文所构质粒预期的酶切鉴定图谱
附表一: 本文所构质粒预期的酶切条带大小
参考文献
致谢
硕士研究生期间发表的学术论文
学位论文评阅及答辩情况表
【参考文献】：
博士论文
[1]microRNA-7敲除小鼠模型的建立及雄性生殖力分析[D]. 林皓.中国农业大学 2019
[2]应用CRISPR/Cas9系统生产NRAMP1基因精准插入的转基因牛[D]. 高元鹏.西北农林科技大学 2017
[3]DNA直接克隆的优化和ccdB反向筛选在Red/ET重组工程中的应用[D]. 王海龙.湖南师范大学 2013
硕士论文
[1]PiggyBac介导CYP3A4转基因肝细胞系的长期稳定表达研究及其药物肝毒性评价[D]. 邹淑香.华南理工大学 2016
[2]基于CRISPR/Cas9系统的基因打靶研究[D]. 刘倩男.河南大学 2015
本文编号：3677972
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一章 绪论
1.1 DNA同源重组工程
1.1.1 DNA同源重组工程简介
1.1.2 DNA同源重组工程原理
1.1.3 DNA同源重组工程的应用
1.2 SCN9A与Na_v1.7
1.2.1 SCN9A与Na_v1.7简介
1.2.2 SCN9A与神经性疼痛病
1.2.3 以Na_v1.7为靶点的镇痛药物的研究与开发
1.3 人工核酸内切酶介导的基因编辑技术
1.3.1 锌指核酸酶(ZFNs)
1.3.2 转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)
1.3.3 由RNA指导的Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)
1.4 立题依据和意义
1.5 技术路线
第二章 人SCN9A基因的BAC缝合
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 培养基、抗生素和诱导剂
2.1.3 重组引物及测序引物
2.1.4 化学试剂
2.1.5 仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌质粒的小量提取与大量提取
2.2.2 酶切鉴定
2.2.3 聚合酶链式反应
2.2.4 DNA的苯酚/氯仿/异戊醇抽提与酒精沉淀
2.2.5 大肠杆菌的电转方法
2.2.6 在GB05-dir中进行线性DNA之间的重组
2.2.7 在GB08-red中进行线性DNA和环形DNA之间的重组
2.3 实验过程及结果分析
2.3.1 BACAlRP11-746P5的修饰
2.3.2 G856D和A1632E点突变
2.3.3 BAC b1 CH17-291A18的修饰
2.3.4 BAC缝合
2.3.5 BAC缝合后修饰
2.4 讨论
第三章 SCN9A人源化小鼠胚胎干细胞的构建
3.1 实验材料
3.1.1 细胞系和质粒
3.1.2 培养基和抗生素
3.1.3 检测引物
3.1.4 化学试剂
3.1.5 仪器设备
3.2 实验方法
3.2.1 脂质体转染
3.2.2 单克隆的挑取
3.2.3 细胞基因组DNA96孔板提取方法
3.3 实验过程及结果分析
3.4 讨论
第四章 Scn9a基因敲除小鼠胚胎干细胞的构建
4.1 实验材料
4.1.1 质粒
4.1.2 重组引物及测序引物
4.2 实验方法
4.2.1 小鼠胚胎干细胞基因打靶的核转染方法
4.2.2 细胞基因组DNA 24孔板提取方法
4.2.3 ExoCET技术
4.3 实验过程及结果分析
4.3.1 gRNA表达质粒的构建
4.3.2 基因打靶载体的构建
4.3.3 基因打靶及基因型分析
4.4 讨论
第五章 全文总结与展望
附图一: 本文所构质粒预期的酶切鉴定图谱
附表一: 本文所构质粒预期的酶切条带大小
参考文献
致谢
硕士研究生期间发表的学术论文
学位论文评阅及答辩情况表
【参考文献】：
博士论文
[1]microRNA-7敲除小鼠模型的建立及雄性生殖力分析[D]. 林皓.中国农业大学 2019
[2]应用CRISPR/Cas9系统生产NRAMP1基因精准插入的转基因牛[D]. 高元鹏.西北农林科技大学 2017
[3]DNA直接克隆的优化和ccdB反向筛选在Red/ET重组工程中的应用[D]. 王海龙.湖南师范大学 2013
硕士论文
[1]PiggyBac介导CYP3A4转基因肝细胞系的长期稳定表达研究及其药物肝毒性评价[D]. 邹淑香.华南理工大学 2016
[2]基于CRISPR/Cas9系统的基因打靶研究[D]. 刘倩男.河南大学 2015
本文编号：3677972
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3677972.html
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