异源GGT酶在乳酸乳球菌中的分泌表达及磁性固定化酶的研究

发布时间：2022-08-23 15:10

　　乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是符合GRAS标准的革兰氏阳性菌,由于其生长快速、新陈代谢简单、遗传背景清晰等特点,在食品工业、临床医药等领域受到了极高的关注度。L.lactis的表达系统有很多种,其中,以Nisin诱导的NICE表达系统应用最为广泛。借助NICE表达系统,越来越多的异源食品酶实现了在L.lactis中的发酵生产。γ-谷氨酰转移酶（GGT）由于其催化谷胱甘肽或其衍生物的水解/将γ-谷氨酰基转移至各种受体的能力而被广泛应用于食品工业和制药领域。为了提高GGT的产量并简化其纯化的过程,本实验将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens BH072）来源的ggt基因和Usp45信号肽基因融合并构建了GGT在L.lactis中分泌表达的重组菌株。又由于游离酶在生物催化中的不稳定性及不可重复使用性,我们通过共价结合的方法将L.lactis中表达的异源GGT酶和MTG酶固定在磁性纳米粒子上,得到了高酶活性、高稳定性和可重复使用的固定化酶。最后,在最佳固定条件下对固定化酶的性质进行探究。主要实验结果如下:（1）提取B.amyloliquef... 

【文章页数】：86 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 乳酸乳球菌概述
        1.1.1 乳酸乳球菌简介
        1.1.2 乳酸乳球菌的表达系统
    1.2 γ-谷氨酰转移酶
        1.2.1 γ-谷氨酰转移酶的来源及分布
        1.2.2 γ-谷氨酰转移酶的结构
        1.2.3 γ-谷氨酰转移酶的催化性质
        1.2.4 γ-谷氨酰转移酶的应用
    1.3 谷氨酰胺转氨酶
        1.3.1 微生物来源的谷氨酰胺转氨酶
        1.3.2 谷氨酰胺转氨酶的结构
        1.3.3 谷氨酰胺转氨酶的催化机制
        1.3.4 谷氨酰胺转氨酶的应用
    1.4 固定化酶概述
        1.4.1 固定化酶的应用
        1.4.2 制备固定化酶的方法
    1.5 磁性纳米材料
    1.6 课题的研究目的意义及研究内容
        1.6.1 课题研究目的及意义
        1.6.2 主要研究内容
第二章 谷氨酰转移酶在乳酸乳球菌中的分泌表达
    2.1 材料与方法
        2.1.1 菌株及质粒
        2.1.2 材料与试剂
        2.1.3 实验试剂的配制
        2.1.4 所用PCR引物及引物的特征
        2.1.5 主要的实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 L.lactis感受态细胞的制备
        2.2.2 GGT进化分析和同源性比对
        2.2.3 诱导型重组表达载体p NZ8048-sp_(usp45)-ggt_(Δsp)的构建
        2.2.4 组成型重组表达载体p NZ8048-P_(p5)-sp_(usp45)-ggt_(Δsp)-6his的构建
        2.2.5 重组SP_(usp45)-GGT-6His的诱导型表达、纯化及表达条件的优化
        2.2.6 重组SP_(usp45)-GGT-6His的组成型表达及纯化
        2.2.7 两种重组表达菌株与原始菌株生长曲线的比较
        2.2.8 蛋白质的纯化
        2.2.9 GGT-6His的酶学性质测定
        2.2.10 GGT-6His催化合成L-茶氨酸及其鉴定
    2.3 数据处理
    2.4 结果与分析
        2.4.1 GGT进化分析及同源性比对
        2.4.2 诱导型重组表达系统的构建
        2.4.3 组成型重组表达系统的构建
        2.4.4 蛋白质表达及表达条件的优化
        2.4.5 生长曲线
        2.4.6 酶学性质的测定
        2.4.7 L-茶氨酸的合成及检测
    2.5 本章小结
第三章 磁性氧化铁纳米材料的制备及固定化酶的研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料与试剂
        3.1.2 实验试剂的配制
        3.1.3 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 多孔磁性Fe_3O_4纳米粒子的制备
        3.2.2 磁性纳米材料的表征
        3.2.3 BaGGT-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
        3.2.4 BaGGT@Fe_3O_4MNPs和游离BaGGT的稳定性比较
        3.2.5 MTG-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
        3.2.6 MTG@Fe_3O_4MNPs和游离MTG的稳定性比较
    3.3 数据处理
    3.4 结果与分析
        3.4.1 多孔磁性纳米粒子的制备
        3.4.2 磁性纳米材料的表征
        3.4.3 BaGGT-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
        3.4.4 MTG-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
    3.5 本章小结
第四章 壳聚糖-磁性纳米粒子的制备及固定化酶的研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料与试剂
        4.1.2 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 壳聚糖-四氧化三铁纳米粒子的制备
        4.2.2 磁性纳米材料的表征
        4.2.3 对CS-Fe_3O_4MNPs表面基团的修饰
        4.2.4 BaGGT-6His在3-APTES/CS-Fe_3O_4MNPs上的固定化
        4.2.5 BaGGT@CS-Fe_3O_4MNPs和游离BaGGT的稳定性比较
    4.3 数据处理
    4.4 结果与分析
        4.4.1 复合磁性纳米材料的制备
        4.4.2 磁性纳米材料的表征
        4.4.3 BaGGT-6His在 CS-Fe_3O_4MNPs上的固定化
    4.5 本章小结
第五章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 本文创新点
    5.3 展望
参考文献
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]功能化磁性纳米材料在磷酸化肽富集中的应用[J]. 熊芳芳,江丹丹,贾琼.  色谱. 2020(01)



本文编号：3677993