猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及遗传进化分析
发布时间：2022-11-06 14:19
猪流行性腹泻病毒（Procine epidemic diaherra virus,PEDV）是猪病毒性腹泻爆发的主要病原之一,在感染仔猪后,会引起猪的流行性腹泻（Procine epidemic diaherra,PED）。哺乳期仔猪发病率及病死率极高。自2010年,PED在我国大面积爆发,因此对PEDV的流行情况进行持续的监测十分必要。本研究首先将PEDV N基因连接到p EASY-Blunt Simple载体,构建标准质粒。利用该质粒上的T7启动子,体外转录RNA模板作为荧光定量RT-PCR的标准品。对灵敏度的验证表明,本研究所建立的实时荧光定量PCR方法最低可以检测到10个拷贝。通过检测多种病毒,评估该方法的特异性及准确度,结果表明,仅PEDV可以扩增到曲线,而其他病原均无曲线扩增;无论是批内重复试验还是批间重复试验,其CT值的变异系数均在2%以下,表明该方法特异性强,准确度高。用建立好的RT-PCR方法对2018-2019年山东省四个地区采集的161份临床样品进行检测,阳性率在25.71-41.93%。这表明PEDV在本研究所取样地区猪群中的流行较为严重,对该病的防控工作刻不容...
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 PEDV的病原学特点
1.1.1 PEDV的形态及理化特征
1.1.2 PEDV的分类
1.2 PEDV的分子生物学
1.2.1 PEDV的复制酶基因及其蛋白
1.2.2 PEDV的 ORF3 基因及其蛋白
1.2.3 PEDV的S基因及其蛋白
1.2.4 PEDV的M基因及其蛋白
1.2.5 PEDV的N基因及其蛋白
1.2.6 PEDV的E基因及其蛋白
1.3 PEDV的流行病学
1.4 PEDV的临床症状和病理变化
1.4.1 临床症状
1.4.2 病理变化
1.5 PEDV的防控
1.5.1 PEDV传统疫苗
1.5.2 PEDV基因工程疫苗
1.6 PEDV的诊断技术
1.7 本研究的目的意义
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 病料来源
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要配制试剂
2.2 方法
2.2.1 PEDV荧光定量RT-PCR检测方法的建立
2.2.1.1 引物和探针的设计
2.2.1.2 样品处理
2.2.1.3 病毒RNA的提取
2.2.1.4 反转录聚合酶链式反应
2.2.1.5 扩增产物的回收
2.2.1.6 回收产物的连接
2.2.1.7 连接产物的转化
2.2.1.8 质粒的提取
2.2.1.9 PEDV-N基因标准质粒的制备
2.2.1.10 荧光定量RT-PCR标准品的制备
2.2.1.11 荧光定量RT-PCR的建立和条件优化
2.2.1.12 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立
2.2.1.13 荧光定量RT-PCR的敏感性检测
2.2.1.14 荧光定量RT-PCR的特异性检测
2.2.1.15 荧光定量RT-PCR的重复性检测
2.2.1.16 临床样品的检测
2.2.2 六株PEDV流行株S基因的遗传进化分析
2.2.2.1 引物设计
2.2.2.2 样品模板的制备
2.2.3.3 PEDV S基因的RT-PCR扩增
2.2.3.4 PEDVS基因的遗传进化分析
2.2.3 SDLY01株的分离与鉴定
2.2.3.1 PEDV流行株的分离
2.2.3.2 间接免疫荧光(IFA)
2.2.4 PEDV SDLY1801 株全基因组序列测定及拼接
2.2.4.1 SDLY1801序列的分段扩增与测序
2.2.4.2 PEDV SDLY1801 毒株遗传进化分析
3 结果与分析
3.1 基于N基因的PEDV荧光定量PCR检测方法的建立
3.1.1 荧光定量PCR标准品的构建
3.1.2 实时荧光定量RT-PCR的建立和条件优化
3.1.3 标准曲线的建立
3.1.4 实时荧光定量PCR的敏感性检测
3.1.5 实时荧光定量PCR的特异性检测
3.1.6 实时荧光定量PCR的重复性检测
3.1.7 临床样品PEDV检测结果
3.2 六株PEDV流行株S基因的分段扩增及分析
3.2.1 PEDV毒株S基因的RT-PCR分段扩增
3.2.2 PEDV毒株S基因的核苷酸和氨基酸同源性分析
3.2.3 PEDV毒株S基因的变异情况分析
3.2.4 PEDV毒株S基因的遗传进化分析
3.3 PEDV SDLY1801 的分离与鉴定与遗传进化分析
3.3.1 PEDV SDLY1801 的分离与鉴定
3.3.2 PEDV SDLY1801 毒株的IFA鉴定
3.3.3 PEDV SDLY1801 的全基因扩增结果
3.3.4 PEDV SDLY1801 株基因组结构分析
3.3.5 PEDV SDLY1801 株基因组同源性与遗传进化分析
3.3.6 PEDV SDLY1801株S基因同源性与遗传进化分析
3.3.7 PEDV SDLY1801株M基因同源性与遗传进化分析
3.3.8 PEDV SDLY1801株N基因同源性与遗传进化分析
3.3.9 PEDV SDLY1801株E基因同源性与遗传进化分析
4 讨论
4.1 PEDV特异性荧光定量RT-PCR方法的建立
4.2 山东部分地区PEDV流行株S基因的序列分析
4.3 山东部分地区PEDV SDLY1801 株的分离鉴定与病毒基因序列分析
5 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒黏液SIgA抗体ELISA检测方法的建立[J]. 王永恒,周孟云,李昱辰,刘朋,杨倩. 中国兽医科学. 2020(01)
[2]基于猪流行性腹泻病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用[J]. 杨朋霞,闫若潜,王华俊,马震原,王淑娟,赵雪丽,谢彩华,赵月龙,李孟. 中国预防兽医学报. 2019(10)
[3]猪流行性腹泻病毒JX16株的分离鉴定及体外传代对其毒力的影响[J]. 唐融志,陈智,焦安琪,赵鲁,于江,张玉玉,孙文博,张树金,曾昊,彭军,吴家强. 中国畜牧兽医. 2019(06)
[4]PEDV双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 马宇聪,刘增素,王书博,周晗,姜艳萍,崔文,王丽,乔薪瑗,唐丽杰,徐义刚,李一经. 中国兽医科学. 2019(09)
[5]2013～2018年广西部分规模猪场主要病毒性腹泻疫病流行病学调查研究[J]. 何颖,秦毅斌,段群棚,张艺杰,卢冰霞,胡庭俊,李晓玉,周英宁,周展宏,刘磊,梁家幸,李斌,蒋冬福,卢敬专,苏乾莲,刘棋,赵武. 中国动物传染病学报. 2019(03)
[6]猪流行性腹泻病毒变异毒株与传统毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立[J]. 赵攀登,赵胜杰,王岩,邓同炜,卢建洲,刘静静,朱文龙,冀梦瑶,陈益. 中国动物传染病学报. 2019(06)
[7]基于DPO引物检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用[J]. 王以欣,王紫薇,汉武娇,王丽,姜艳平,崔文,周晗,乔薪瑗,唐丽杰,李一经,徐义刚. 中国预防兽医学报. 2019(07)
[8]PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达[J]. 何海健,吴瑗,王鲁彦,李群景,巴少波,石林,邵春艳,孙静,姜胜,王晓杜. 中国畜牧兽医. 2019(03)
[9]猪流行性腹泻传染性胃肠炎双重RT-PCR检测方法的建立及优化[J]. 赵光伟,涂少宇,汪洋,贺然,赖靖尧,谭阳春,郭道兵,牛晨霞,杨晓伟. 中国兽医杂志. 2018(10)
[10]基于PEDV M基因RT-LAMP快速检测方法的建立与应用[J]. 陈希文,尹苗,汪谦,杨勤,杨凤,李莲,罗文涛,周杰珑,马缨,赵洪. 中国兽医学报. 2018(09)
硕士论文
[1]猪流行性腹泻病毒（PEDV）S蛋白高变区（1-496aa）线性B细胞表位肽的鉴定[D]. 刘英杰.齐鲁工业大学 2019
[2]猪四种腹泻病毒快速鉴别检测方法及猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究[D]. 王睿敏.广西大学 2019
[3]猪流行性腹泻病毒重组沙门氏菌的构建及免疫原性分析[D]. 徐丽丽.华中农业大学 2011
[4]猪传染性胃肠炎和流行性腹泻二联核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.东北农业大学 2011
本文编号：3703652
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 PEDV的病原学特点
1.1.1 PEDV的形态及理化特征
1.1.2 PEDV的分类
1.2 PEDV的分子生物学
1.2.1 PEDV的复制酶基因及其蛋白
1.2.2 PEDV的 ORF3 基因及其蛋白
1.2.3 PEDV的S基因及其蛋白
1.2.4 PEDV的M基因及其蛋白
1.2.5 PEDV的N基因及其蛋白
1.2.6 PEDV的E基因及其蛋白
1.3 PEDV的流行病学
1.4 PEDV的临床症状和病理变化
1.4.1 临床症状
1.4.2 病理变化
1.5 PEDV的防控
1.5.1 PEDV传统疫苗
1.5.2 PEDV基因工程疫苗
1.6 PEDV的诊断技术
1.7 本研究的目的意义
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 病料来源
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要配制试剂
2.2 方法
2.2.1 PEDV荧光定量RT-PCR检测方法的建立
2.2.1.1 引物和探针的设计
2.2.1.2 样品处理
2.2.1.3 病毒RNA的提取
2.2.1.4 反转录聚合酶链式反应
2.2.1.5 扩增产物的回收
2.2.1.6 回收产物的连接
2.2.1.7 连接产物的转化
2.2.1.8 质粒的提取
2.2.1.9 PEDV-N基因标准质粒的制备
2.2.1.10 荧光定量RT-PCR标准品的制备
2.2.1.11 荧光定量RT-PCR的建立和条件优化
2.2.1.12 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立
2.2.1.13 荧光定量RT-PCR的敏感性检测
2.2.1.14 荧光定量RT-PCR的特异性检测
2.2.1.15 荧光定量RT-PCR的重复性检测
2.2.1.16 临床样品的检测
2.2.2 六株PEDV流行株S基因的遗传进化分析
2.2.2.1 引物设计
2.2.2.2 样品模板的制备
2.2.3.3 PEDV S基因的RT-PCR扩增
2.2.3.4 PEDVS基因的遗传进化分析
2.2.3 SDLY01株的分离与鉴定
2.2.3.1 PEDV流行株的分离
2.2.3.2 间接免疫荧光(IFA)
2.2.4 PEDV SDLY1801 株全基因组序列测定及拼接
2.2.4.1 SDLY1801序列的分段扩增与测序
2.2.4.2 PEDV SDLY1801 毒株遗传进化分析
3 结果与分析
3.1 基于N基因的PEDV荧光定量PCR检测方法的建立
3.1.1 荧光定量PCR标准品的构建
3.1.2 实时荧光定量RT-PCR的建立和条件优化
3.1.3 标准曲线的建立
3.1.4 实时荧光定量PCR的敏感性检测
3.1.5 实时荧光定量PCR的特异性检测
3.1.6 实时荧光定量PCR的重复性检测
3.1.7 临床样品PEDV检测结果
3.2 六株PEDV流行株S基因的分段扩增及分析
3.2.1 PEDV毒株S基因的RT-PCR分段扩增
3.2.2 PEDV毒株S基因的核苷酸和氨基酸同源性分析
3.2.3 PEDV毒株S基因的变异情况分析
3.2.4 PEDV毒株S基因的遗传进化分析
3.3 PEDV SDLY1801 的分离与鉴定与遗传进化分析
3.3.1 PEDV SDLY1801 的分离与鉴定
3.3.2 PEDV SDLY1801 毒株的IFA鉴定
3.3.3 PEDV SDLY1801 的全基因扩增结果
3.3.4 PEDV SDLY1801 株基因组结构分析
3.3.5 PEDV SDLY1801 株基因组同源性与遗传进化分析
3.3.6 PEDV SDLY1801株S基因同源性与遗传进化分析
3.3.7 PEDV SDLY1801株M基因同源性与遗传进化分析
3.3.8 PEDV SDLY1801株N基因同源性与遗传进化分析
3.3.9 PEDV SDLY1801株E基因同源性与遗传进化分析
4 讨论
4.1 PEDV特异性荧光定量RT-PCR方法的建立
4.2 山东部分地区PEDV流行株S基因的序列分析
4.3 山东部分地区PEDV SDLY1801 株的分离鉴定与病毒基因序列分析
5 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒黏液SIgA抗体ELISA检测方法的建立[J]. 王永恒,周孟云,李昱辰,刘朋,杨倩. 中国兽医科学. 2020(01)
[2]基于猪流行性腹泻病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用[J]. 杨朋霞,闫若潜,王华俊,马震原,王淑娟,赵雪丽,谢彩华,赵月龙,李孟. 中国预防兽医学报. 2019(10)
[3]猪流行性腹泻病毒JX16株的分离鉴定及体外传代对其毒力的影响[J]. 唐融志,陈智,焦安琪,赵鲁,于江,张玉玉,孙文博,张树金,曾昊,彭军,吴家强. 中国畜牧兽医. 2019(06)
[4]PEDV双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 马宇聪,刘增素,王书博,周晗,姜艳萍,崔文,王丽,乔薪瑗,唐丽杰,徐义刚,李一经. 中国兽医科学. 2019(09)
[5]2013～2018年广西部分规模猪场主要病毒性腹泻疫病流行病学调查研究[J]. 何颖,秦毅斌,段群棚,张艺杰,卢冰霞,胡庭俊,李晓玉,周英宁,周展宏,刘磊,梁家幸,李斌,蒋冬福,卢敬专,苏乾莲,刘棋,赵武. 中国动物传染病学报. 2019(03)
[6]猪流行性腹泻病毒变异毒株与传统毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立[J]. 赵攀登,赵胜杰,王岩,邓同炜,卢建洲,刘静静,朱文龙,冀梦瑶,陈益. 中国动物传染病学报. 2019(06)
[7]基于DPO引物检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用[J]. 王以欣,王紫薇,汉武娇,王丽,姜艳平,崔文,周晗,乔薪瑗,唐丽杰,李一经,徐义刚. 中国预防兽医学报. 2019(07)
[8]PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达[J]. 何海健,吴瑗,王鲁彦,李群景,巴少波,石林,邵春艳,孙静,姜胜,王晓杜. 中国畜牧兽医. 2019(03)
[9]猪流行性腹泻传染性胃肠炎双重RT-PCR检测方法的建立及优化[J]. 赵光伟,涂少宇,汪洋,贺然,赖靖尧,谭阳春,郭道兵,牛晨霞,杨晓伟. 中国兽医杂志. 2018(10)
[10]基于PEDV M基因RT-LAMP快速检测方法的建立与应用[J]. 陈希文,尹苗,汪谦,杨勤,杨凤,李莲,罗文涛,周杰珑,马缨,赵洪. 中国兽医学报. 2018(09)
硕士论文
[1]猪流行性腹泻病毒（PEDV）S蛋白高变区（1-496aa）线性B细胞表位肽的鉴定[D]. 刘英杰.齐鲁工业大学 2019
[2]猪四种腹泻病毒快速鉴别检测方法及猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究[D]. 王睿敏.广西大学 2019
[3]猪流行性腹泻病毒重组沙门氏菌的构建及免疫原性分析[D]. 徐丽丽.华中农业大学 2011
[4]猪传染性胃肠炎和流行性腹泻二联核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.东北农业大学 2011
本文编号：3703652
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3703652.html
