睾丸酮丛毛单胞菌TetR蛋白与其顺式元件相互作用机制探索

发布时间：2023-02-14 11:01

　　类固醇类化合物会引起人和某些动物的生殖障碍、畸形、机体发育异常和癌症等疾病,它可能成为21世纪人类生殖健康所面临的最大挑战。而睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)是一种以类固醇类化合物为碳源的微生物。其3,17β-羟基类固醇脱氢酶(3,17β-HSD)是诱导降解类固醇类化合物的关键酶,位于3,17β-HSD下游的TetR编码的蛋白可能作为3,17β-HSD的调控因子,抑制3,17β-HSD基因的表达,降低对类固醇分解作用。本研究尝试构建TetR基因的突变菌株,分析TetR与3,17β-HSD的调控关系;同时构建TetR基因表达载体,分析其活性蛋白与3,17β-HSD调控序列的结合位点。研究睾丸酮丛毛单胞菌TetR与3,17β-HSD表达调控关系对利用微生物降解的原理治理环境激素污染起到重要作用。实验主要分为两大部分,第一部分是:构建含有331 bp TetR突变基因的pK18-TetR载体,利用基因重组方法获得TetR基因的突变菌株,通过分光光度法分析突变菌和野生菌的生长趋势变化,并对睾丸酮诱导下野生菌与突变菌中3,17β-HSD表达及遗传稳定性进行分析,初...

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
英文缩写符号
第一章 绪论
    1.1 睾丸酮丛毛单胞菌的研究进展
        1.1.1 睾丸酮丛毛单胞菌
        1.1.2 睾丸酮丛毛单胞菌降解类固醇的关键酶
    1.2 基因敲除
    1.3 凝胶迁移实验
    1.4 金纳米粒子光吸收特性及应用
    1.5 研究内容与展望
第二章 TETR基因敲除菌株的构建及其3,17Β-HSD对睾丸酮的响应特性
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株及质粒
        2.1.2 仪器与药品
        2.1.3 主要试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 TetR基因敲除的C.testosteroni突变菌株的构建
        2.2.2 3 ,17β-HSD的表达和纯化
        2.2.3 ELISA测定3,17β-HSD蛋白的表达
        2.2.4 睾丸酮对突变菌株3,17β-HSD蛋白的诱导表达
        2.2.5 突变菌株遗传稳定性
    2.3 结果与分析
        2.3.1 重组质粒和TetR基因敲除菌株的构建
        2.3.2 3,17β-HSD的表达和纯化
        2.3.3 3,17β-HSD蛋白表达量的标准曲线
        2.3.4 睾丸酮对突变菌株3,17β-HSD的诱导效应
        2.3.5 突变菌株的遗传稳定性检测
    2.4 小结
第三章 TETR蛋白对3,17Β-HSD表达调控位点的分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 质粒和菌株
        3.1.2 仪器与药品
        3.1.3 主要试剂配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 pET-15b-TetR基因表达载体的构建
        3.2.2 TetR活性蛋白的提取
        3.2.3 EMSA和金纳米粒子比色法测定TetR蛋白与DNA的相互作用
    3.3 实验结果
        3.3.1 重组质粒pET-15b-TetR的鉴定
        3.3.2 TetR活性蛋白的提取
        3.3.3 EMSA试验分析TetR蛋白与DNA的相互作用
        3.3.4 金纳米粒子比色法测定TetR蛋白与DNA的相互作用
    3.4 小结
结论
参考文献
致谢



本文编号：3742486