塑料降解酶（PETase）在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其酶学性质的改良研究
发布时间：2023-02-26 04:48
目前,聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料(PET)的广泛使用已对生态环境造成严重污染,而焚烧和化学降解等方法带来的二次污染同样严峻,因此更为温和的生物降解为PET的回收提供了可能性。据报道来源于Ideonella sakaiensis的塑料降解酶PETase表现出比其他酶更高的PET水解活性。枯草芽孢杆菌是公认的生物安全性菌株,且具有强大的分泌能力,是良好的异源基因表达宿主。在基因表达中,启动子是直接影响基因表达水平的重要基因组调控元件,而信号肽则决定了蛋白的外泌能力。所以外源基因的成功高效率表达不仅要选择合适的宿主菌株,合适的启动子和信号肽同样重要。在本研究中,我们利用枯草芽孢杆菌对PETase进行外泌表达,并选择了5个信号肽和2个启动子来介导PETase的胞外分泌,并以天然信号肽SPPETase作为对照。通过正交设计,构建了7株工程菌,分别是:WB600-P43-SPAprE,WB600-P43-SPapr,WB600-P43-SPBprA,WB600-P43-SPSacC,WB600-P43-SP
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 PET简介
1.1.1 塑料污染
1.1.2 PET合成
1.1.3 PET回收处理
1.2 PET生物降解
1.2.1 PET生物降解简介
1.2.2 PET降解酶
1.2.3 新型PET降解酶PETase
1.3 枯草芽孢杆菌表达系统与表达原件
1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统
1.3.2 启动子对外源基因表达影响
1.3.3 信号肽对外源基因表达影响
1.4 酶分子的工程改造
1.4.1 定向进化
1.4.2 理性与半理性设计
1.5 立题意义与主要研究内容
1.5.1 立题意义
1.5.2 主要研究内容
第二章 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 主要仪器
2.1.3 工具酶、引物与测序、试剂盒及试剂
2.1.4 培养基
2.1.5 相关溶液
2.2 表达载体在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达纯化及检测
2.2.1 表达载体在大肠杆菌(E.coli)TOP10 中的克隆
2.2.2 表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达
2.2.3 表达载体在枯草芽孢杆菌WB600中的表达
2.2.4 表达蛋白的检测
2.3 酶活检测方法
2.3.1 p-NPP法测定蛋白质酶活
2.3.2 蛋白水解BHET活性检测
2.4 启动子及信号肽的筛选
2.4.1 WB600-P43-SPamy工程菌的构建
2.4.2 培养温度的确定
2.4.3 WB600-P43-SPsp工程菌的构建
2.4.4 不同信号肽介导下PETase外泌情况
2.4.5 WB600-Pylb-SPamy工程菌的构建
2.4.6 不同启动子介导下PETase外泌情况
2.4.7 扫描电镜实验
2.5 半理性设计提高PETase的热稳定性
2.5.1 突变位点的选择
2.5.2 突变表达载体的构建
2.5.3 大肠杆菌BL21(DE3)突变工程菌株的构建及表达
2.5.4 PETase及其突变体蛋白活性测定
2.5.5 最适温度测定
2.5.6 热稳定性测定
2.5.7 突变体rmsd、rmsf的确定及作用力的分析
第三章 结果与分析
3.1 启动子及信号肽筛选提高PETase在枯草芽孢杆菌中的表达量
3.1.1 PETase重组表达菌株的构建
3.1.2 工程菌培养温度的测定
3.1.3 不同信号肽对PETase分泌表达的影响
3.1.4 不同启动子对PETase分泌表达的影响
3.1.5 检测分泌的PETase水解BHET
3.1.6 通过分泌的PETase检测降解的PET膜
3.1.7 小结
3.2 半理性设计提高PETase的热稳定
3.2.1 突变位点的选择
3.2.2 突变体的构建与表达
3.2.3 单点突变体的初筛
3.2.4 突变体酶学性质测定
3.2.5 突变体稳定性提高的分子机制
3.2.6 小结
第四章 主要结论与展望
4.1 主要结论
4.2 展望
致谢
参考文献
附录 Ⅰ:作者在攻读硕士学位期间发表的论文
附录 Ⅱ:英文缩略表
本文编号：3749849
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 PET简介
1.1.1 塑料污染
1.1.2 PET合成
1.1.3 PET回收处理
1.2 PET生物降解
1.2.1 PET生物降解简介
1.2.2 PET降解酶
1.2.3 新型PET降解酶PETase
1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统
1.3.2 启动子对外源基因表达影响
1.3.3 信号肽对外源基因表达影响
1.4 酶分子的工程改造
1.4.1 定向进化
1.4.2 理性与半理性设计
1.5 立题意义与主要研究内容
1.5.1 立题意义
1.5.2 主要研究内容
第二章 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 主要仪器
2.1.3 工具酶、引物与测序、试剂盒及试剂
2.1.4 培养基
2.1.5 相关溶液
2.2 表达载体在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达纯化及检测
2.2.1 表达载体在大肠杆菌(E.coli)TOP10 中的克隆
2.2.2 表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达
2.2.3 表达载体在枯草芽孢杆菌WB600中的表达
2.2.4 表达蛋白的检测
2.3 酶活检测方法
2.3.1 p-NPP法测定蛋白质酶活
2.3.2 蛋白水解BHET活性检测
2.4 启动子及信号肽的筛选
2.4.1 WB600-P43-SPamy工程菌的构建
2.4.2 培养温度的确定
2.4.3 WB600-P43-SPsp工程菌的构建
2.4.4 不同信号肽介导下PETase外泌情况
2.4.5 WB600-Pylb-SPamy工程菌的构建
2.4.6 不同启动子介导下PETase外泌情况
2.4.7 扫描电镜实验
2.5 半理性设计提高PETase的热稳定性
2.5.1 突变位点的选择
2.5.2 突变表达载体的构建
2.5.3 大肠杆菌BL21(DE3)突变工程菌株的构建及表达
2.5.4 PETase及其突变体蛋白活性测定
2.5.5 最适温度测定
2.5.6 热稳定性测定
2.5.7 突变体rmsd、rmsf的确定及作用力的分析
第三章 结果与分析
3.1 启动子及信号肽筛选提高PETase在枯草芽孢杆菌中的表达量
3.1.1 PETase重组表达菌株的构建
3.1.2 工程菌培养温度的测定
3.1.3 不同信号肽对PETase分泌表达的影响
3.1.4 不同启动子对PETase分泌表达的影响
3.1.5 检测分泌的PETase水解BHET
3.1.6 通过分泌的PETase检测降解的PET膜
3.1.7 小结
3.2 半理性设计提高PETase的热稳定
3.2.1 突变位点的选择
3.2.2 突变体的构建与表达
3.2.3 单点突变体的初筛
3.2.4 突变体酶学性质测定
3.2.5 突变体稳定性提高的分子机制
3.2.6 小结
第四章 主要结论与展望
4.1 主要结论
4.2 展望
致谢
参考文献
附录 Ⅰ:作者在攻读硕士学位期间发表的论文
附录 Ⅱ:英文缩略表
本文编号：3749849
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3749849.html
