CRISPR/Cas9介导下敲除KNDC1的人脐静脉内皮细胞具有抗衰老能力

发布时间：2023-03-04 12:20

　　目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的KNDC1并观察其抗衰老能力。方法通过在线软件设计靶向于KNDC1外显子1、2、3的5个sgRNAs,并将其构建到CRISPR/Cas9载体中;经测序确认序列正确后,将重组质粒转染HeLa细胞和HUVECs,48 h后用real-time PCR和Western blot分别检测KNDC1 mRNA和蛋白表达水平;用SA-β-gal染色检测细胞衰老情况;用2, 7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧水平。结果测序结果显示,设计的5个sgRNAs全部插入到了CRISPR/Cas9载体中,序列正确,构建成功。将5个重组质粒转染到HeLa细胞后发现第4和5号载体敲除效率较高,接下来将4和5号重组质粒转染到HUVECs中,发现与转染对照质粒相比,转染了4和5号重组质粒的HUVECs KNDC1 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05),衰老HUVECs数量和细胞内活性氧水平明显减少。结论利用CRISPR/Cas9技术能有效敲除HUVECs的KNDC1,敲除KNDC1的HUV...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 细胞系:
        1.1.2 载体和试剂:
        1.1.3 引物合成和测序:
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA打靶载体的构建:
        1.2.2 在HeLa细胞中验证打靶载体的敲除效率:
        1.2.3 在HUVECs中进行KNDC1敲除:
        1.2.4 SA-β-gal染色检测细胞衰老:
        1.2.5 MTT法检测细胞增殖能力:
        1.2.6 细胞内活性氧水平的检测:
    1.3 统计学分析
2 结果
    2.1 用于人 KNDC1敲除的打靶载体的构建
    2.2 筛选打靶效率高的重组质粒
    2.3 在HUVECs中对KNDC1进行敲除验证
    2.4 敲除KNDC1能够延缓HUVECs衰老、增强细胞增殖能力及降低其活性氧水平
3 讨论



本文编号：3754280