细菌趋化性组氨酸激酶CheA的催化结构域与调节结构域之间连接的功能研究

发布时间：2023-03-11 18:47

　　细菌趋化性是双组分信号转导系统中一典型信号转导途径。在该途径中,组氨酸激酶CheA自磷酸化,催化ATP的水解,并将高能磷酸基团传递给CheA的同源应答调控分子CheY。磷酸化的CheY蛋白与鞭毛马达蛋白相互作用,引起鞭毛转动方向的改变,进而改变细菌游动的方向。细菌趋化性信号的转导除了双组分CheA和CheY,还需要耦合蛋白CheW和跨膜化学受体的配合。CheA的调节结构域(P5)、CheW和跨膜化学受体三者相互作用,形成非常稳定的信号复合物。在信号复合物内,CheA的激酶活性受到调节,跨膜化学受体感受到外界环境信号后,信号复合物表现出激酶开或者激酶关的输出状态,细菌的游动行为就反应了受体信号复合物在这两种状态下的比例。所以,组氨酸激酶CheA在细菌趋化性信号的融合、转换和放大过程中发挥着核心作用。尽管近些年来本研究领域在理解信号复合物结构方面取得了突破,但是在这一结构框架内CheA激酶活性被调节的分子机制依然不清晰。前期的研究结果显示,CheA的催化结构域(P4)和调节结构域之间的域间连接,P4-P5连接,可能介导从P5-CheW-受体相互作用界面到催化结构域P4的调节信号的传递。为了...

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要名词缩写
1 引言
    1.1 研究背景
    1.2 趋化性信号转导通路及相关蛋白
    1.3 组氨酸激酶CheA及核心信号复合物的结构
    1.4 组氨酸激酶CheA活性调节机制的研究进展
    1.5 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 质粒和菌株
        2.1.2 主要实验用酶和实验试剂
        2.1.3 主要实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 本项研究涉及的基本实验方法
            2.2.1.1 PCR
            2.2.1.2 电转化感受态的制备
            2.2.1.3 电转化
            2.2.1.4 化学转化感受态的制备
            2.2.1.5 化学转化
            2.2.1.6 质粒抽提
        2.2.2 组氨酸激酶CheA的P4-P5连接突变株的分离
            2.2.2.1 P4-P5连接突变载体的构建
            2.2.2.2 P4-P5连接突变株的获取
            2.2.2.3 P4-P5连接突变株的筛选及验证
        2.2.3 CheA蛋白的制备
            2.2.3.1 突变载体的分子构建
            2.2.3.2 CheA蛋白表达菌株的获得
            2.2.3.3 CheA蛋白的表达与纯化
        2.2.4 CheW蛋白的制备
            2.2.4.1 CheW蛋白表达菌株的获得和蛋白的表达
            2.2.4.2 CheW蛋白的纯化
        2.2.5 CheY蛋白的制备
            2.2.5.1 CheY蛋白的表达
            2.2.5.2 CheY蛋白的纯化
        2.2.6 含细胞膜的Tsr受体蛋白的制备
        2.2.7 信号复合物的体外重建
        2.2.8 Western Blot蛋白质检测
        2.2.9 ATP酶分析法
        2.2.10 CheA蛋白的体外激活实验
        2.2.11 CheA蛋白的体内激活实验
    2.3 数据分析处理
3 结果与分析
    3.1 连接突变株的分离
    3.2 连接突变体的细菌体内验证
    3.3 连接突变CheA蛋白的体外活性
    3.4 连接突变CheA蛋白的细菌体内趋化作用
    3.5 连接突变CheA蛋白对信号复合物的影响
    3.6 连接突变CheA蛋白的体外激活作用
    3.7 在缺少P5结构域的情况下连接突变体的效应
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间取得的学术成果目录



本文编号：3760047