OsCPK12基因功能研究及互作蛋白筛选

发布时间：2023-03-11 19:21

　　在植物生长发育和适应环境的过程中,存在许多信号调控网络。Ca²⁺作为重要的第二信使,在植物响应体内外刺激,传递信号进而调节体内各种生理生化反应中起到关键的作用。钙离子依赖的蛋白激酶(CPKs)是植物中广泛存在的一类钙离子结合蛋白,参与植物生长发育,生物和非生物胁迫的调节过程,是植物钙离子信号级联反应的重要组成部分。本研究从水稻CPK12基因参与逆境调控和激素信号调控着手,通过反向遗传学研究方法,构建OsCPK12基因敲除和超表达突变体,用150 mmol/L的NaCl进行盐胁迫处理后,超表达株系无论株高,根长还是叶片状态都优于野生型,而基因敲除突变体相比于野生型株高明显矮化,根的发育形态差,叶片枯黄。证实OsCPK12对水稻耐盐有正调控作用。用real-time PCR对突变体株系的根、叶鞘、叶片多个部位的激素信号转导路径基因的表达量进行分析,结果显示,超表达株系的多个激素受体编码基因和下游调控基因表达量显著上调,说明OsCPK12参与激素的信号转导并影响水稻抗逆反应。为进一步研究OsCPK12的基因功能,通过在水稻原生质体中表达融合蛋白进行OsCPK12的亚细胞...

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 研究问题的由来
    1.2 文献综述
        1.2.1 CPK的发现和基本结构
        1.2.2 CPKs活性调节
        1.2.3 CPKs的定位和分布
    1.3 CPKs的生物学功能
        1.3.1 CPKs参与植物对盐胁迫和干旱的调控
        1.3.2 CPKs参与冷胁迫应答
        1.3.3 CPKs参与ABA信号通路
        1.3.4 CPKs参与活性氧平衡调节
        1.3.5 CPKs参与植物生长发育调控
        1.3.6 CPKs参与病原菌防御活动
        1.3.7 CPKs的作用底物
        1.3.8 CPKs与其他信号通路的交叉
2 研究目的及意义
3 材料方法
    3.1 OsCPK12遗传材料构建
        3.1.1 基因敲除和超表达载体构建
        3.1.2 农杆菌侵染法转化水稻
    3.2 转基因植株的分子检测
        3.2.1 基因敲除材料检测
        3.2.2 超表达材料拷贝数检测
    3.3 突变体盐胁迫处理
        3.3.1 材料选取
        3.3.2 处理方法
    3.4 激素marker基因表达量分析
    3.5 蛋白亚细胞定位
    3.6 互作蛋白筛选
    3.7 双分子荧光互补验证蛋白互作
    3.8 荧光素酶酶活恢复验证蛋白互作
4 实验结果
    4.1 相关载体构建
        4.1.1 基因敲除载体构建
        4.1.2 超表达和酵母双杂交载体构建
    4.2 OsCPK12基因功能
    4.3 OsCPK12参与多个激素信号通路
    4.4 OsCPK12 的亚细胞定位
    4.5 OsCPK12的互作蛋白筛选
        4.5.1 OsCPK12自激活检测
        4.5.2 文库筛选和结果
        4.5.3 候选蛋白的点对点验证
    4.6 双分子荧光互补实验验证互作
    4.7 荧光素酶酶活恢复实验验证互作
5 讨论与展望
6 参考文献
附录
    附录Ⅰ 部分实验操作方法
        Protocol 1 农杆菌介导的粳稻遗传转化
        Protocol 2 水稻叶片DNA的抽提
        Protocol 3 Southern blot
        Protocol 4 水稻叶片RNA抽提和反转录
        Protocol 5 高质量质粒抽提
        Protocol 6 水稻原生质体抽提和转化
        Protocol 7 酵母双杂膜蛋白筛选
    附录Ⅱ: 部分引物序列
致谢



本文编号：3760094