细菌双组分信号转导系统中组氨酸激酶HK853的功能及其抑制剂机制研究

发布时间：2023-03-19 19:28

　　双组分信号转导系统(Two-Component Signal Transduction System,TCS)是一类主要存在于细菌中的用于感知外界信号刺激并作出应答的系统。目前已经发现总共200-300种不同的TCS,而一个细菌中包含约20种TCS。TCS蛋白的结构和功能相对保守,对于细菌的生长、繁殖和耐药等生命活动至关重要,但同时却并不存在于人类及哺乳动物细胞中,因此TCS被认为是一种潜在的新型抗菌药物靶点。常规的一个TCS由一对蛋白质组成,分别为组氨酸激酶(Histine kinase,HK)和应答调节蛋白(Response Regulator,RR)。TCS系统通过磷酸传递发挥其生物学功能,即HK蛋白感知外界信号刺激后与ATP反应并完成自磷酸化,自磷酸化完成后的HK蛋白可以将下游RR蛋白磷酸化,被磷酸化的RR蛋白会与对应的基因相结合,并调控其表达。HK蛋白不仅可以使RR蛋白磷酸化,其同时具有将磷酸化的RR蛋白去磷酸化的功能,HK蛋白通过磷酸激酶和磷酸酶的双功能,精准调控磷酸化RR的量,以完成对信号刺激的准确应答。HK蛋白作为一种多功能的酶类,针对其功能的抑制剂研究相对于RR较多,...

【文章页数】：127 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略语表
第1章 绪论
    1.1 双组分信号转导系统介绍
        1.1.1 双组分信号转导系统功能机制
        1.1.2 HK蛋白的结构与功能
            1.1.2.1 Sensor domain及transmembrane domain的结构与功能
            1.1.2.2 Linker domain的结构与功能
            1.1.2.3 DHp domain及CA domain的结构与功能
        1.1.3 RR蛋白的结构与功能
            1.1.3.1 Receiver domain的结构特点
            1.1.3.2 Effector domain的结构特点
        1.1.4 针对TCS的抑菌剂研究进展
    1.2 木犀草素介绍
        1.2.1 木犀草素的抗氧化作用
        1.2.2 木犀草素的抗菌及消除耐药作用
        1.2.3 木犀草素的抗炎作用
        1.2.4 木犀草素的抗肿瘤作用
        1.2.5 木犀草素的其他药理作用
    1.3 ATP合成酶介绍
        1.3.1 F₁F_O-ATP合成酶的结构和功能
        1.3.2 F₁F_O-ATP合成酶的结构和功能
        1.3.3 V₁V_O-ATP合成酶的结构和功能
        1.3.4 ATP合成酶特点总结
    1.4 核磁共振介绍
        1.4.1 核磁共振波谱仪的介绍
        1.4.2 常见的核磁共振观测参数
        1.4.3 常见的核磁共振实验
        1.4.4 常用的核磁共振基本参数
    1.5 等温滴定量热实验介绍
    1.6 主要研究内容
第2章 组氨酸激酶HK853^cp、HK853^CA等蛋白质及突变体的表达
    2.1 前言
    2.2 试剂与仪器
        2.2.1 实验试剂
        2.2.2 实验仪器
    2.3 HK853^cp、HK853^CA及其突变体蛋白质表达前准备
        2.3.1 HK853^cp、HK853^CA及其突变体的重组质粒构建
        2.3.2 不同突变体的引物设计
        2.3.3 PCR扩增目的片段
        2.3.4 酶切、质粒提取及转化
    2.4 HK853^cp、HK853^CA及其突变体的表达
        2.4.1 非标蛋白的表达
        2.4.2 ¹⁵N/¹³C单标/双标蛋白的表达
    2.5 HK853^cp、HK853^CA以及其突变体的纯化
        2.5.1 HK853^cp及其突变体的纯化
        2.5.2 HK853^CA及其突变体的纯化
    2.6 RR468的表达及纯化
        2.6.1 RR468蛋白的表达
        2.6.2 RR468蛋白的纯化
    2.7 EnvZ^cp的纯化及表达
        2.7.1 EnvZ^cp蛋白的表达
        2.7.2 EnvZ^cp蛋白的纯化
    2.8 结果与讨论
        2.8.1 HK853^cp蛋白表达纯化结果
        2.8.2 HK853^CA蛋白表达纯化结果
    2.9 结论
第3章 组氨酸激酶HK853^CA的主链及侧链归属
    3.1 前言
    3.2 试剂与仪器
        3.2.1 实验试剂
        3.2.2 实验仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 反应条件
        3.3.2 NMR实验
        3.3.3 HK853^CA的主链及侧链归属
    3.4 结果与讨论
    3.5 结论
第4章 木犀草素对HK853自磷酸化活性抑制作用机制研究
    4.1 前言
    4.2 试剂与仪器
        4.2.1 实验试剂
        4.2.2 实验仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 NMR实验方法
        4.3.2 ITC实验方法
        4.3.3 分子模拟方法
        4.3.4 抑菌试验方法
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 ³¹P NMR实验结果
            4.4.1.1 ³¹P NMR分析方法的可行性分析
            4.4.1.2 ³¹P NMR分析Lut的抑制活性
        4.4.2 ITC定量分析木犀草素与HK853的亲和力
        4.4.3 ¹⁵N-¹H HSQC滴定分析木犀草素对HK853^CA的影响
        4.4.4 分子模拟结果
        4.4.5 结构类似黄酮类物质功能验证
        4.4.6 木犀草素等物质的抑菌作用分析
    4.5 结论
第5章 HK853 ATP Lid对自磷酸化活性影响的研究
    5.1 前言
    5.2 试剂与仪器
        5.2.1 实验试剂
        5.2.2 实验仪器
    5.3 实验方法
        5.3.1 ¹⁵N-¹H HSQC实验方法
        5.3.2 ITC实验方法
        5.3.3 ³¹P谱实验方法
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 ¹⁵N-¹H HSQC实验结果
        5.4.2 ITC定量分析突变对亲和力的影响
        5.4.3 ³¹p NMR分析突变对HK853自磷酸化活性的影响
    5.5 结论
第6章 HK853的ATP合成功能的研究
    6.1 前言
    6.2 试剂与仪器
        6.2.1 实验试剂
        6.2.2 实验仪器
    6.3 实验方法
        6.3.1 ³¹P谱实验方法
        6.3.2 ¹⁵N-¹H HSQC实验方法
    6.4 结果与讨论
        6.4.1 ADP与HK853^CA反应³¹P NMR实验结果
        6.4.2 ¹⁵N-¹H HSQC实验观察ADP与HK853^CA的反应
        6.4.3 HK853^CA和HK853^cp与ADP反应速率对比
        6.4.4 HK853^H260A和HK853^cp与ADP反应速率对比
        6.4.5 HK853 ATP Lid突变对HK853与ADP反应的影响
        6.4.6 HK853^CA四种突变体(已知影响激酶功能)与ADP反应结果
        6.4.7 HK853自磷酸化活性与ATP合成活性对比
        6.4.8 基于ADP的HK853→RR468磷酸传递实验结果
        6.4.9 HK家族其他蛋白质与ADP反应结果
        6.4.10 HK蛋白是否是一种无差别的“磷酸键加工厂”?
        6.4.11 HK蛋白合成ATP机制推测
    6.5 结论
第7章 总结和展望
    7.1 总结
    7.2 展望
参考文献
附录A 氨基酸中英文对照表
附录B 常用培养基配方及配制过程
附录C 电泳实验中所用到的配方及配制过程
致谢
作者简历及攻读博士学位期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3765821