肌肉特异表达Cas9示踪载体的构建及其胚胎整合
发布时间：2023-04-01 23:39
近年来以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术发展迅速,其广泛应用于细胞模型和活体转基因模型的建立。研究者大多采用靶位点sgRNA联合Cas9蛋白显微注射到动物胚胎实现活体水平目的基因的编辑。为探讨能否利用CRISPR/Cas9实现动物体肌肉组织特异的基因编辑,本研究利用Rosa26基因的广谱性表达,在此基因位置发生序列变化不影响其他基因功能的特性,将Cas9基因连接到人工合成的肌肉特异表达启动子(SP启动子)下游,在C2C12(骨骼肌细胞的前体细胞)中检测该系统的编辑效率,在此基础上构建Rosa26位点的同源重组载体,该载体可以整合到C2C12细胞和小鼠胚胎,为肌肉组织特异的基因编辑研究奠定基础。具体情况如下:1.PX459-Rosa26-SP-DsRed示踪载体的构建将实验室前期工作中构建PX459-Rosa26(该载体带有针对Rosa26位点的sgRNA片段)的CMV启动子替换为肌肉特异启动子SP,构建PX459-Rosa26-SP载体。XbaI酶切未切开显示打靶后C2C12细胞的XbaI位点破坏,T7E1切开显示发生切割并NHEJ修复,该载体成功打靶Rosa26基因位点,并...
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 基因编辑技术
1.1.1 基因编辑技术的发展
1.1.2 CRISPR/Cas系统作用原理
1.1.3 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统的比较
1.1.4 CRISPR/Cas9在细胞和动物模型建立中的应用
1.2 时空特异性基因编辑
1.2.1 条件性基因敲除
1.2.2 组织特异性基因编辑
1.2.3 肌肉特异性启动子SP
1.3 基因敲入位点
1.3.1 Rosa26位点基因敲入“安全港”
1.3.2 AAVS腺病毒相关病毒整合位点
1.4 研究的目的及意义
2 肌肉特异性表达Cas9示踪载体的构建
2.1. 实验材料
2.1.1 载体信息
2.1.2 主要试剂和药品
2.1.3 实验仪器及设备
2.2 实验方法
2.2.1 SP启动子的PCR扩增
2.2.2 Rosa26-PX459-SP载体构建
2.2.3 Rosa26-PX459-SP载体酶切
2.2.4 PX459-Rosa26-SP-DsRed示踪载体的构建
2.2.5 Rosa26-PX459-SP在C2C12细胞中编辑活性检测
2.2.6 PX459-Rosa26-SP-DsRed示踪载体的检测
2.3 实验结果
2.3.1 SP启动子的扩增
2.3.2 Rosa26-PX459-SP载体构建
2.3.3 Rosa26位点Cas9示踪载体的构建
2.3.4 PX459-Rosa26-SP表达活性检验
2.4 讨论
2.5 本章小结
3 肌肉特异表达Cas9示踪同源打靶载体在C2C12细胞中的整合
3.1 实验材料
3.1.1 实验载体信息
3.1.2 主要试剂及药品
3.1.3 主要设备及仪器
3.1.4 溶液配制
3.2 实验方法
3.2.1 同源臂载体Donor的酶切
3.2.2 SP-Cas9-DsRed的克隆
3.2.3 Donor-Cas9-SP-DsRed的连接
3.2.4 细胞的培养与转染
3.2.5 PCR鉴定基因敲入情况
3.3 实验结果
3.3.1 同源打靶载体的构建及表达活性检测
3.3.2 同源载体在C2C12细胞Rosa26位点的整合
3.4 讨论
3.5 本章小结
4 肌肉特异表达Cas9示踪载体在小鼠胚胎中的整合
4.1 实验材料
4.1.1 实验动物和菌株
4.1.2 实验载体信息
4.1.3 药品和试剂
4.1.4 溶液配制
4.1.5 主要仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 注射用小鼠Rosa26基因sgRNA的制备
4.2.2 小鼠Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测
4.2.3 小鼠胚胎的显微注射
4.2.4 小鼠Rosa26基因敲除胚胎编辑效率检测
4.2.5 同源打靶载体敲入胚胎编辑效率检测
4.2.6 胚胎移植
4.2.7 出生小鼠基因分型检测
4.3 结果
4.3.1 Rosa26 sgRNA的体外编辑效率
4.3.2 Rosa26 sgRNA在小鼠胚胎中的编辑效率
4.3.3 同源重组载体敲入胚胎效率
4.3.4 胚胎移植后的活体编辑效率
4.4 讨论
4.5 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
本文编号：3778088
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
1 绪论
1.1 基因编辑技术
1.1.1 基因编辑技术的发展
1.1.2 CRISPR/Cas系统作用原理
1.1.3 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统的比较
1.1.4 CRISPR/Cas9在细胞和动物模型建立中的应用
1.2 时空特异性基因编辑
1.2.1 条件性基因敲除
1.2.2 组织特异性基因编辑
1.2.3 肌肉特异性启动子SP
1.3 基因敲入位点
1.3.1 Rosa26位点基因敲入“安全港”
1.3.2 AAVS腺病毒相关病毒整合位点
1.4 研究的目的及意义
2 肌肉特异性表达Cas9示踪载体的构建
2.1. 实验材料
2.1.1 载体信息
2.1.2 主要试剂和药品
2.1.3 实验仪器及设备
2.2 实验方法
2.2.1 SP启动子的PCR扩增
2.2.2 Rosa26-PX459-SP载体构建
2.2.3 Rosa26-PX459-SP载体酶切
2.2.4 PX459-Rosa26-SP-DsRed示踪载体的构建
2.2.5 Rosa26-PX459-SP在C2C12细胞中编辑活性检测
2.2.6 PX459-Rosa26-SP-DsRed示踪载体的检测
2.3 实验结果
2.3.1 SP启动子的扩增
2.3.2 Rosa26-PX459-SP载体构建
2.3.3 Rosa26位点Cas9示踪载体的构建
2.3.4 PX459-Rosa26-SP表达活性检验
2.4 讨论
2.5 本章小结
3 肌肉特异表达Cas9示踪同源打靶载体在C2C12细胞中的整合
3.1 实验材料
3.1.1 实验载体信息
3.1.2 主要试剂及药品
3.1.3 主要设备及仪器
3.1.4 溶液配制
3.2 实验方法
3.2.1 同源臂载体Donor的酶切
3.2.2 SP-Cas9-DsRed的克隆
3.2.3 Donor-Cas9-SP-DsRed的连接
3.2.4 细胞的培养与转染
3.2.5 PCR鉴定基因敲入情况
3.3 实验结果
3.3.1 同源打靶载体的构建及表达活性检测
3.3.2 同源载体在C2C12细胞Rosa26位点的整合
3.4 讨论
3.5 本章小结
4 肌肉特异表达Cas9示踪载体在小鼠胚胎中的整合
4.1 实验材料
4.1.1 实验动物和菌株
4.1.2 实验载体信息
4.1.3 药品和试剂
4.1.4 溶液配制
4.1.5 主要仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 注射用小鼠Rosa26基因sgRNA的制备
4.2.2 小鼠Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测
4.2.3 小鼠胚胎的显微注射
4.2.4 小鼠Rosa26基因敲除胚胎编辑效率检测
4.2.5 同源打靶载体敲入胚胎编辑效率检测
4.2.6 胚胎移植
4.2.7 出生小鼠基因分型检测
4.3 结果
4.3.1 Rosa26 sgRNA的体外编辑效率
4.3.2 Rosa26 sgRNA在小鼠胚胎中的编辑效率
4.3.3 同源重组载体敲入胚胎效率
4.3.4 胚胎移植后的活体编辑效率
4.4 讨论
4.5 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
本文编号：3778088
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