异源重组表达嵌合裂解酶及其相关酶学性质的比较
发布时间：2023-04-02 04:29
近年来,噬菌体裂解酶已广泛用于生物控制中代替抗生素,并且它们在人类,动物和其他养殖动物的传染病的预防和治疗中起重要作用。裂解酶通常都在原核的大肠杆菌系统中表达,但存在产量低、不稳定、可溶性差以及细胞毒性高等缺点。因此,本研究旨在构建出高效安全的酵母表达系统以生产获得广谱嵌合裂解酶ClyV,为实现临床应用进一步奠定基础。本研究将扩增得到的ClyV基因,经双酶切后与酵母表达载体pPIC3.5k和pPIC9k相连接得到了pPIC3.5k-ClyV和pPIC9k-ClyV,采用电转化导入毕赤酵母中,并通过遗传霉素抗性平板筛选得到了阳性酵母多拷贝菌株。利用甲醇对上述得到的毕赤酵母pPIC3.5k-ClyV和pPIC9k-ClyV工程菌进行诱导发酵,而后经镍柱亲和层析法纯化得到了裂解酶ClyVp1和ClyVp2。同时对本实验室保藏的大肠杆菌BL21/pET 28a-ClyV工程菌也进行原核胞内诱导表达,并经镍柱亲和层析纯化得到了裂解酶ClyVe。ClyV裂解酶在大肠杆菌和毕赤酵母中均实现了正确表达,就ClyV的表达量和溶解度来看酵母系统相对更佳为了进一步比较毕赤酵母来源的ClyVp与大肠杆菌来源的...
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号缩写说明
1 绪论
1.1 裂解酶的结构和溶菌机制
1.2 噬菌体裂解酶的优势
1.2.1 不产生细菌抗性
1.2.2 特异性介于抗生素和噬菌体之间
1.2.3 刺激产生的相关抗体不会削弱其杀菌作用
1.2.4 作用高效迅速
1.2.5 可与抗生素产生协同效应
1.3 裂解酶改造
1.4 嵌合裂解酶ClyV
1.5 裂解酶异源表达系统
1.6 酵母表达系统
1.6.1 常见的几个酵母表达系统
1.6.2 设计最佳外源蛋白表达系统
1.6.3 毕赤酵母的启动元件
1.6.4 毕赤酵母常见菌株类型
1.6.5 毕赤酵母表达载体
1.6.6 毕赤酵母的外源基因偏好
1.6.7 毕赤酵母的翻译和修饰
1.6.8 毕赤酵母多拷贝
1.6.9 毕赤酵母的发酵
1.7 本研究立题依据
1.8 本研究的目的意义
2 异源重组表达嵌合裂解酶及其相关酶学性质的比较
2.1 实验材料与试剂
2.1.1 菌株
2.1.2 引物
2.1.3 试剂和材料
2.1.4 培养基的配制
2.1.5 溶液的配制
2.1.6 仪器
2.2 实验方法
2.2.1 大肠表达系统克隆工程菌ClyV的表达和活化
2.2.2 大肠杆菌工程菌的扩大培养
2.2.3 大肠杆菌工程菌的诱导表达
2.2.4 菌体收集与破碎
2.3 酵母表达ClyV
2.3.1 ClyV基因的提取
2.3.2 pPIC3.5k-ClyV和 pPIC3.5k-ClyV表达载体的构建
2.3.3 转入酵母
2.3.4 重组工程菌的筛选及验证
2.3.5 重组工程菌的异源表达
2.3.6 胞外分泌和胞内表达产物的收集和纯化
2.3.7 样品预处理和蛋白纯化
2.3.8 SDS-PAGE电泳
2.3.9 蛋白浓度测定
2.3.10 去除内毒素
2.3.11 内毒素检测
2.4 异源裂解酶的定性定量杀菌测试
2.5 异源ClyV的特征比较
2.5.1 异源ClyV的浓度依赖性
2.5.2 温度对异源ClyV的影响
2.5.3 pH对异源ClyV活性的影响
2.5.4 离子强度对ClyV活性的影响
2.5.5 EDTA浓度对异源ClyV活性的影响
2.5.6 酵母ClyV的杀菌谱
2.5.7 异源ClyV的细胞毒性实验
3 结果
3.1 ClyV酵母表达载体的构建
3.2 酵母重组工程菌多拷贝筛选
3.3 异源ClyV表达纯化
3.4 异源ClyV的杀菌活性分析
3.5 ClyV的酶活性质分析
3.6 ClyV的杀菌谱
3.7 ClyV内毒素含量及其细胞毒性
4 讨论
5 全文总结
5.1 本研究的主要结论
5.2 本研究创新之处
5.3 研究展望
致谢
参考文献
攻读学位期间研究成果
本文编号：3778536
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号缩写说明
1 绪论
1.1 裂解酶的结构和溶菌机制
1.2 噬菌体裂解酶的优势
1.2.1 不产生细菌抗性
1.2.2 特异性介于抗生素和噬菌体之间
1.2.3 刺激产生的相关抗体不会削弱其杀菌作用
1.2.4 作用高效迅速
1.2.5 可与抗生素产生协同效应
1.3 裂解酶改造
1.4 嵌合裂解酶ClyV
1.5 裂解酶异源表达系统
1.6 酵母表达系统
1.6.1 常见的几个酵母表达系统
1.6.2 设计最佳外源蛋白表达系统
1.6.3 毕赤酵母的启动元件
1.6.4 毕赤酵母常见菌株类型
1.6.5 毕赤酵母表达载体
1.6.6 毕赤酵母的外源基因偏好
1.6.7 毕赤酵母的翻译和修饰
1.6.8 毕赤酵母多拷贝
1.6.9 毕赤酵母的发酵
1.7 本研究立题依据
1.8 本研究的目的意义
2 异源重组表达嵌合裂解酶及其相关酶学性质的比较
2.1 实验材料与试剂
2.1.1 菌株
2.1.2 引物
2.1.3 试剂和材料
2.1.4 培养基的配制
2.1.5 溶液的配制
2.1.6 仪器
2.2 实验方法
2.2.1 大肠表达系统克隆工程菌ClyV的表达和活化
2.2.2 大肠杆菌工程菌的扩大培养
2.2.3 大肠杆菌工程菌的诱导表达
2.2.4 菌体收集与破碎
2.3 酵母表达ClyV
2.3.1 ClyV基因的提取
2.3.2 pPIC3.5k-ClyV和 pPIC3.5k-ClyV表达载体的构建
2.3.3 转入酵母
2.3.4 重组工程菌的筛选及验证
2.3.5 重组工程菌的异源表达
2.3.6 胞外分泌和胞内表达产物的收集和纯化
2.3.7 样品预处理和蛋白纯化
2.3.8 SDS-PAGE电泳
2.3.9 蛋白浓度测定
2.3.10 去除内毒素
2.3.11 内毒素检测
2.4 异源裂解酶的定性定量杀菌测试
2.5 异源ClyV的特征比较
2.5.1 异源ClyV的浓度依赖性
2.5.2 温度对异源ClyV的影响
2.5.3 pH对异源ClyV活性的影响
2.5.4 离子强度对ClyV活性的影响
2.5.5 EDTA浓度对异源ClyV活性的影响
2.5.6 酵母ClyV的杀菌谱
2.5.7 异源ClyV的细胞毒性实验
3 结果
3.1 ClyV酵母表达载体的构建
3.2 酵母重组工程菌多拷贝筛选
3.3 异源ClyV表达纯化
3.4 异源ClyV的杀菌活性分析
3.5 ClyV的酶活性质分析
3.6 ClyV的杀菌谱
3.7 ClyV内毒素含量及其细胞毒性
4 讨论
5 全文总结
5.1 本研究的主要结论
5.2 本研究创新之处
5.3 研究展望
致谢
参考文献
攻读学位期间研究成果
本文编号：3778536
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3778536.html
