RUNX1c及GATA2表达质粒构建及其在肝细胞中表达的鉴定

发布时间：2023-04-03 23:51

　　目的构建含RUNX1c及GATA2基因的表达质粒,探讨水动力转染法能否实现其在小鼠肝中的表达。方法采用PCR方法分别扩增RUNX1c及GATA2基因序列,并分别连入T载体中,通过双酶切、连接反应将2个基因序列分别连入慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中。将含RUNX1c及GATA2基因的慢病毒毒液转染至L-02细胞,通过qPCR方法检测目的基因表达。通过水动力高压转染方法将此两种质粒通过尾静脉注入小鼠体内,于转染24 h,取小鼠肝组织,对组织切片进行抗RUNX1及GATA2抗体的免疫荧光染色;于转染72 h,通过流式细胞术分选肝组织中GFP+细胞,实时定量PCR(qPCR)检测RUNX1c、GATA2及造血相关基因的表达。结果经双酶切及测序鉴定证明,pCDH-MCS-T2A-RUNX1c-copGFP-MSCV、pCDH-MCS-T2A-GATA2-copGFP-MSCV质粒构建成功。通过体外实验证实这两个载体携带的RUNX1c及GATA2基因能在人肝细胞系L-02中表达。水动力高压转染法可使含RUNX1c及GATA2的质粒进入肝组织,并在肝细胞中表达RUNX1...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 基因、质粒、菌株、细胞
        1.1.2 实验动物
        1.1.3 试剂和设备
    1.2 方法
        1.2.1 RUNX1c和GATA2引物的设计与合成
        1.2.2 RUNX1c和GATA2基因片段的PCR扩增
        1.2.3 RUNX1c和GATA2重组质粒的构建及鉴定
        1.2.4 水动力转染质粒
        1.2.5 流式细胞术检测
        1.2.6 组织切片免疫荧光和免疫组化染色
        1.2.7 慢病毒毒液感染L-02细胞
    1.3 统计学分析
2结果
    2.1 RUNX1c基因表达载体的构建
    2.2 GATA2基因表达载体的构建
    2.3携带RUNX1c、GATA2基因的慢病毒毒液包装及感染L-02细胞
    2.4水动力转染RUNX1c及GATA2的表达质粒及其在肝中表达的检测
    2.5携带RUNX1c及GATA2基因的质粒在肝细胞中的表达
    2.6 RUNX1c及GATA2基因表达后启动造血相关转录因子表达
3讨论



本文编号：3781385