普鲁兰酶催化效率强化的分子改造及其分泌表达调控
发布时间：2023-04-04 01:07
普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是一类催化支链淀粉、普鲁兰多糖及相关聚合物的a-1,6糖苷键水解的淀粉脱支酶。由于普鲁兰酶水解支链淀粉分支点的特性,在糖化过程中添加普鲁兰酶,将减少所需的糖化酶用量以及糖化反应时间,从而显著提高淀粉生物质的水解效率。因此,普鲁兰酶在食品、制药、能源和高聚物材料等领域有重要的商业价值。而且,作为研究糖类物质结构的工具,普鲁兰酶也受到了极大的关注。然而,多数普鲁兰酶的催化效率和稳定性较低,因此面临着生产成本提高,无法大规模应用于工业化生产的问题。长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)来源的普鲁兰酶具有耐酸耐热的酶学特性,在pH 4.5,60°C条件下酶活水平最高。本论文基于序列结构信息对B.naganoensis普鲁兰酶进行蛋白质工程改造。通过截断氨基酸序列的无序区域、进化偶联位点饱和突变、三密码子饱和突变等策略,提高了B.naganoensis普鲁兰酶的酶活、比活、催化效率以及应用效果。此外,分别通过在酶分子N-末端融合带负电的多肽和过量表达羧肽酶的方式提高了其在E.coli中的胞外分泌效率。主要研究结果如下:(1)基于B.nagano...
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词注释表
第一章 绪论
1.1 普鲁兰酶
1.1.1 普鲁兰酶的分类
1.1.2 普鲁兰酶的相关应用
1.2 普鲁兰酶的酶学特性
1.3 普鲁兰酶的结构与催化机制
1.4 普鲁兰酶分子改造的研究进展
1.5 酶分子改造策略
1.5.1 蛋白质工程
1.5.2 定向进化
1.5.3 理性设计
1.5.4 半理性设计
1.6 普鲁兰酶的异源表达
1.7 本研究的目的和意义
1.8 主要研究内容
第二章 基于序列无序性截短改造普鲁兰酶
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 菌株与质粒
2.2.2 试剂和仪器
2.2.3 培养基与溶液
2.2.4 基因工程操作
2.2.5 重组质粒提取及测序
2.2.6 重组菌的摇瓶发酵
2.2.7 重组蛋白的纯化
2.2.8 普鲁兰酶活力测定及SDS-PAGE
2.2.9 重组蛋白酶学性质分析
2.2.10 重组蛋白3D结构模拟
2.3 结果与讨论
2.3.1 普鲁兰酶氨基酸序列的无序性分析
2.3.2 截短突变体的构建与重组表达
2.3.3 截短突变体的动力学参数测定
2.3.4 截短突变体的酶学性质分析
2.3.5 重组蛋白的圆二色(Circular dichroism,CD)分析
2.3.6 重组蛋白结构模拟及比对分析
2.4 小结
第三章 基于进化偶联饱和突变策略的普鲁兰酶全序列分析
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 菌株与质粒
3.2.2 试剂和仪器
3.2.3 培养基与溶液
3.2.4 基因工程操作
3.2.5 自诱导红色普鲁兰平板可视化筛选单克隆
3.2.6 重组菌的摇瓶发酵
3.2.7 重组蛋白的纯化
3.2.8 普鲁兰酶活力测定及SDS-PAGE
3.2.9 重组蛋白酶学性质分析
3.2.10 普鲁兰酶3D结构模拟
3.3 结果与讨论
3.3.1 普鲁兰酶氨基酸序列的进化偶联分析
3.3.2 ECs的选择与突变文库的构建
3.3.3 突变文库的筛选
3.3.4 ECSM双位点突变体的酶活及动力学参数测定
3.3.5 ECSM双位点突变体的酶学性质分析
3.3.6 位点A232/I226 的距离分析
3.4 小结
第四章 普鲁兰酶结构域氨基酸序列进化偶联分析及改造
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 菌株与质粒
4.2.2 试剂和仪器
4.2.3 培养基与溶液
4.2.4 基因工程操作
4.2.5 自诱导红色普鲁兰平板可视化筛选单克隆
4.2.6 重组菌的摇瓶发酵
4.2.7 重组蛋白的纯化
4.2.8 普鲁兰酶活力测定及SDS-PAGE
4.2.9 重组蛋白酶学性质分析
4.2.10 预反应态(pre-reaction state,PRS)分子动力学模拟
4.3 结果与讨论
4.3.1 结构域氨基酸序列进化偶联分析
4.3.2 ECs的选择与突变文库的构建
4.3.3 两步法突变方法有效性验证
4.3.4 ECSM双位点突变体的酶活及动力学参数测定
4.3.5 ECSM双位点突变体的酶学性质分析
4.3.6 ECSM四位点突变体的构建与表达
4.3.7 ECSM四位点突变体的酶学性质分析
4.3.8 ECs保守性及距离分析
4.3.9 PRS分子动力学模拟
4.4 小结
第五章 普鲁兰酶催化口袋活性位点组合饱和突变
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 菌株与质粒
5.2.2 试剂和仪器
5.2.3 培养基及溶液
5.2.4 基因工程操作
5.2.5 自诱导红色普鲁兰平板可视化筛选单克隆
5.2.6 重组菌的摇瓶发酵
5.2.7 重组蛋白的纯化
5.2.8 普鲁兰酶活力测定及SDS-PAGE
5.2.9 重组蛋白酶学性质分析
5.2.10 重组蛋白3D结构模拟
5.3 结果与讨论
5.3.1 催化口袋改造位点的选择
5.3.2 TCSM突变文库构建及活性位点的识别
5.3.3 位点D787和M621 突变文库的构建
5.3.4 重组蛋白的比活力与动力学参数测定
5.3.5 重组蛋白的酶学性质分析
5.3.6 重组蛋白3D结构模拟及分析
5.4 小结
第六章 普鲁兰酶在E.coli中的分泌表达及突变体的应用
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 菌株与质粒
6.2.2 试剂和仪器
6.2.3 培养基与溶液
6.2.4 基因工程操作
6.2.5 重组菌的摇瓶发酵
6.2.6 重组蛋白的纯化
6.2.7 普鲁兰酶活力测定及SDS-PAGE
6.2.8 重组蛋白酶学性质分析
6.2.9 糖化反应
6.2.10 糖化产物HPLC分析
6.2.11 DE值、DX值和IM值的测定
6.3 结果与讨论
6.3.1 WT的 N-末端融合负电肽链对其在E.coli中胞外分泌的影响
6.3.2 DN106的N-末端融合负电肽链对其在E.coli中胞外分泌的影响
6.3.3 细胞壁通透性调控
6.3.4 突变体的组合、表达及活性测定
6.3.5 组合突变体在糖化反应中的效果分析
6.4 小结
主要结论与展望
主要结论
展望
论文主要创新点
致谢
参考文献
附录 :表
附录 :图
附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文
本文编号：3781492
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【学位级别】：博士
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摘要
Abstract
缩略词注释表
第一章 绪论
1.1 普鲁兰酶
1.1.1 普鲁兰酶的分类
1.1.2 普鲁兰酶的相关应用
1.2 普鲁兰酶的酶学特性
1.3 普鲁兰酶的结构与催化机制
1.4 普鲁兰酶分子改造的研究进展
1.5 酶分子改造策略
1.5.1 蛋白质工程
1.5.2 定向进化
1.5.3 理性设计
1.5.4 半理性设计
1.6 普鲁兰酶的异源表达
1.7 本研究的目的和意义
1.8 主要研究内容
第二章 基于序列无序性截短改造普鲁兰酶
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 菌株与质粒
2.2.2 试剂和仪器
2.2.3 培养基与溶液
2.2.4 基因工程操作
2.2.5 重组质粒提取及测序
2.2.6 重组菌的摇瓶发酵
2.2.7 重组蛋白的纯化
2.2.8 普鲁兰酶活力测定及SDS-PAGE
2.2.9 重组蛋白酶学性质分析
2.2.10 重组蛋白3D结构模拟
2.3 结果与讨论
2.3.1 普鲁兰酶氨基酸序列的无序性分析
2.3.2 截短突变体的构建与重组表达
2.3.3 截短突变体的动力学参数测定
2.3.4 截短突变体的酶学性质分析
2.3.5 重组蛋白的圆二色(Circular dichroism,CD)分析
2.3.6 重组蛋白结构模拟及比对分析
2.4 小结
第三章 基于进化偶联饱和突变策略的普鲁兰酶全序列分析
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 菌株与质粒
3.2.2 试剂和仪器
3.2.3 培养基与溶液
3.2.4 基因工程操作
3.2.5 自诱导红色普鲁兰平板可视化筛选单克隆
3.2.6 重组菌的摇瓶发酵
3.2.7 重组蛋白的纯化
3.2.8 普鲁兰酶活力测定及SDS-PAGE
3.2.9 重组蛋白酶学性质分析
3.2.10 普鲁兰酶3D结构模拟
3.3 结果与讨论
3.3.1 普鲁兰酶氨基酸序列的进化偶联分析
3.3.2 ECs的选择与突变文库的构建
3.3.3 突变文库的筛选
3.3.4 ECSM双位点突变体的酶活及动力学参数测定
3.3.5 ECSM双位点突变体的酶学性质分析
3.3.6 位点A232/I226 的距离分析
3.4 小结
第四章 普鲁兰酶结构域氨基酸序列进化偶联分析及改造
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 菌株与质粒
4.2.2 试剂和仪器
4.2.3 培养基与溶液
4.2.4 基因工程操作
4.2.5 自诱导红色普鲁兰平板可视化筛选单克隆
4.2.6 重组菌的摇瓶发酵
4.2.7 重组蛋白的纯化
4.2.8 普鲁兰酶活力测定及SDS-PAGE
4.2.9 重组蛋白酶学性质分析
4.2.10 预反应态(pre-reaction state,PRS)分子动力学模拟
4.3 结果与讨论
4.3.1 结构域氨基酸序列进化偶联分析
4.3.2 ECs的选择与突变文库的构建
4.3.3 两步法突变方法有效性验证
4.3.4 ECSM双位点突变体的酶活及动力学参数测定
4.3.5 ECSM双位点突变体的酶学性质分析
4.3.6 ECSM四位点突变体的构建与表达
4.3.7 ECSM四位点突变体的酶学性质分析
4.3.8 ECs保守性及距离分析
4.3.9 PRS分子动力学模拟
4.4 小结
第五章 普鲁兰酶催化口袋活性位点组合饱和突变
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 菌株与质粒
5.2.2 试剂和仪器
5.2.3 培养基及溶液
5.2.4 基因工程操作
5.2.5 自诱导红色普鲁兰平板可视化筛选单克隆
5.2.6 重组菌的摇瓶发酵
5.2.7 重组蛋白的纯化
5.2.8 普鲁兰酶活力测定及SDS-PAGE
5.2.9 重组蛋白酶学性质分析
5.2.10 重组蛋白3D结构模拟
5.3 结果与讨论
5.3.1 催化口袋改造位点的选择
5.3.2 TCSM突变文库构建及活性位点的识别
5.3.3 位点D787和M621 突变文库的构建
5.3.4 重组蛋白的比活力与动力学参数测定
5.3.5 重组蛋白的酶学性质分析
5.3.6 重组蛋白3D结构模拟及分析
5.4 小结
第六章 普鲁兰酶在E.coli中的分泌表达及突变体的应用
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 菌株与质粒
6.2.2 试剂和仪器
6.2.3 培养基与溶液
6.2.4 基因工程操作
6.2.5 重组菌的摇瓶发酵
6.2.6 重组蛋白的纯化
6.2.7 普鲁兰酶活力测定及SDS-PAGE
6.2.8 重组蛋白酶学性质分析
6.2.9 糖化反应
6.2.10 糖化产物HPLC分析
6.2.11 DE值、DX值和IM值的测定
6.3 结果与讨论
6.3.1 WT的 N-末端融合负电肽链对其在E.coli中胞外分泌的影响
6.3.2 DN106的N-末端融合负电肽链对其在E.coli中胞外分泌的影响
6.3.3 细胞壁通透性调控
6.3.4 突变体的组合、表达及活性测定
6.3.5 组合突变体在糖化反应中的效果分析
6.4 小结
主要结论与展望
主要结论
展望
论文主要创新点
致谢
参考文献
附录 :表
附录 :图
附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文
本文编号：3781492
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3781492.html
