基于化学酶法合成的肝素寡糖探究肝素酶Ⅰ的催化切割模式

发布时间：2023-04-27 21:50

　　肝素和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是由葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)残基与氨基葡萄糖(GlcN)残基以1→4糖苷键连接而成的二糖重复单元组成的糖胺聚糖,因糖链长短不一、各糖单元存在可变的硫酸化、异构化等修饰,使其成为分子量、精细结构不均一的多组分混合物,并表现出多种多样的生物活性。作为有机合成中最具挑战性的研究领域之一,国内外多个研究小组已成功发展了许多肝素/HS寡糖合成的新方法和策略,实现了特定结构肝素寡糖的定向合成,但现有单纯化学合成策略存在反应步数多、合成效率极低等不足。课题组前期通过模拟肝素的体内生物合成途径,成功发展了一种以多酶催化反应为主的、温和的化学方法为辅的化学酶法合成方法,这种全新的技术具有步骤少、产率高等优点,被认为是最具有发展前途的肝素寡糖合成策略。因此,本课题以之前建立的化学酶法合成技术为基础,有针对性地引入温和的化学修饰方法对合成特定寡糖进行N-脱硫酸化修饰以突破修饰酶对底物识别的限制,从而构建结构更加丰富的肝素寡糖化合物库。此外,肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)产生的肝素酶Ⅰ(hepari...

【文章页数】：128 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
ABSTRACT
缩略词及符号说明表
第一章 前言
    1. 肝素
        1.1 肝素和硫酸乙酰肝素的结构特征
        1.2 肝素/HS的功能概况
            1.2.1 抗凝活性
            1.2.2 抗肿瘤活性
            1.2.3 抗炎活性
            1.2.4 抗病毒活性
        1.3 肝素/HS寡糖的合成概况
            1.3.1 化学合成法
            1.3.2 化学酶法合成
    2. 肝素酶
        2.1 肝素酶的来源和种类
        2.2 肝素酶的应用
            2.2.1 体外循环中消除肝素
            2.2.2 生产低分子肝素
            2.2.3 研究肝素的精细结构
            2.2.4 其他
        2.3 肝素酶研究存在的问题及展望
    3. 本课题研究的目的和意义
        3.1 前期研究工作
        3.2 本课题拟解决的关键问题
第二章 糖基供体与硫酸基供体的制备
    1. 糖基供体的制备
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验试剂与耗材
            1.1.2 实验仪器
        1.2 实验方法
            1.2.1 UDP-GlcA的合成
        1.3 实验结果
            1.3.1 UDP-GlcA的合成、纯化及鉴定
        1.4 UDP-GlcNTFA的合成、纯化及鉴定
            1.4.1 GIcNTFA的合成
            1.4.2 NahK、GlmU、PPA的提取及纯化
            1.4.3 UDP-GlcNTFA的合成、纯化及鉴定
        1.5 实验结果
            1.5.1 UDP-GIcNTFA的合成、纯化及鉴定
    2. 硫酸基供体PAPS的制备
        2.1 实验材料
            2.1.1 实验试剂与耗材
            2.1.2 实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 重组KAST-APSK的制备
            2.2.2 PAPS的合成
            2.2.3 PAPS的纯化及鉴定
        2.3 实验结果
            2.3.1 PAPS的合成、纯化及鉴定
    3. 讨论
    4. 本章小结
第三章 肝素寡糖的合成及结构鉴定
    1. 寡糖骨架合成
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验试剂与耗材
            1.1.2 实验仪器
        1.2 实验方法
            1.2.1 KfiA和PmHS2酶的制备
            1.2.2 寡糖骨架合成、纯化及结构鉴定
        1.3 结果与分析
            1.3.1 骨架合成、纯化及结构鉴定
    2. N-硫酸化修饰
        2.1 实验材料
            2.1.1 实验试剂与耗材
            2.1.2 实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 NST酶的制备
            2.2.2 N-硫酸化肝素五糖的合成、纯化及结构鉴定
        2.3 结果与分析
            2.3.1 N-硫酸化肝素五糖的合成、纯化及结构鉴定
    3. C₅异构化和C₅异构化/2-O硫酸化修饰
        3.1 实验材料
            3.1.1 实验试剂与耗材
            3.1.2 实验仪器
        3.2 实验方法
            3.2.1 C₅-epi和2-OST酶的制备
            3.2.2 Penta-NS-IdoA的合成、纯化及结构鉴定
            3.2.3 Penta-NS-IdoA2S的合成、纯化及结构鉴定
        3.3 结果与分析
            3.3.1 Penta-NS-IdoA的合成、纯化及结构鉴定
            3.3.2 Penta-NS-IdoA2S的合成、纯化及结构鉴定
    4. 6-O-硫酸化修饰
        4.1 实验材料
            4.1.1 实验试剂与耗材
            4.1.2 实验仪器
        4.2 实验方法
            4.2.1 6-OST-1/3酶的制备
            4.2.2 Penta-NS6S的合成
            4.2.3 Penta-NS6S-IdoA的合成
            4.2.4 Penta-NS6S-IdoA2S的合成
            4.2.5 6-O-硫酸化肝素五糖的纯化及结构鉴定
        4.3 结果与分析
            4.3.1 Penta-NS6S的合成、纯化及结构鉴定
            4.3.2 Penta-NS6S-IdoA的合成、纯化及结构鉴定
            4.3.3 Penta-NS6S-IdoA2S的合成、纯化及结构鉴定
    5. N-脱硫酸化修饰
        5.1 实验材料
            5.1.1 实验试剂与耗材
            5.1.2 实验仪器
        5.2 试验方法
            5.2.1 N-位脱硫酸化修饰
            5.2.2 N-位脱硫酸化肝素寡糖的纯化及结构鉴定
        5.3 结果与分析
            5.3.1 Penta-NH₂6S的合成、纯化及结构鉴定
            5.3.2 Penta-NH₂6S-IdoA的合成、纯化及结构鉴定
            5.3.3 Penta-NH₂-IdoA2S的合成、纯化及结构鉴定
            5.3.4 Penta-NH₂6S-IdoA2S的合成、纯化及结构鉴定
    6. 讨论
    7. 本章小结
第四章 肝素酶I对肝素寡糖的催化切割模式研究
    1. 实验材料
        1.1 实验试剂与耗材
        1.2 实验仪器
    2. 实验方法
        2.1 重组肝素酶Ⅰ的制备及活性测定
        2.2 肝素寡糖底物的合成
        2.3 肝素酶Ⅰ的动力学分析
        2.4 肝素酶Ⅰ的底物特异性测定
        2.5 肝素酶Ⅰ对不同寡糖底物切割的差异
        2.6 肝素酶Ⅰ和底物之间的相互作用测定
            2.6.1 肝素酶Ⅰ的生物素化
            2.6.2 动力学测定
    3. 结果与分析
        3.1 肝素酶Ⅰ的制备及活性测定
        3.2 肝素寡糖底物的合成
        3.3 肝素酶Ⅰ的动力学分析
        3.4 肝素酶Ⅰ的底物特异性分析
            3.4.1 肝素酶Ⅰ对GlcN-UA的切割作用
            3.4.2 肝素酶Ⅰ对GlcNS6S-UA2S的切割作用
            3.4.3 肝素酶Ⅰ对GlcNS-UA2S的切割作用
            3.4.4 肝素酶Ⅰ对GlcNS6S-UA的切割作用
            3.4.5 肝素酶Ⅰ对肝素寡糖底物切割的偏好性
            3.4.6 肝素酶Ⅰ与底物相互作用的分析
    4. 讨论
    5. 本章小结
第五章 总结与展望
    1. 全文总结
    2. 展望
参考文献
致谢
学位论文评阅及答辩情況表



本文编号：3803130