细胞黏附结构中重要蛋白质复合物IPP的结构生物学研究

发布时间：2023-05-04 00:42

　　近几十年来,通过结构、细胞和遗传学的研究表明,细胞和细胞外基质通过细胞黏着斑(Focal adhesion,FA)进行“由内到外”和“由外到内”的双向信号传导,从而调节细胞内蛋白质的表达和细胞骨架动态变化,来调控细胞的伸展、迁移、增殖和凋亡等过程。黏着斑是由跨膜受体整合素(Integrin)介导的,多种蛋白质组装而成的一种特殊结构(包括整联蛋白)。许多研究表明,ILK蛋白(Integrin-linked kinase)在细胞中广泛表达,是黏着斑的重要蛋白质组成之一,参与调控细胞骨架,以及通过和各种信号分子相互作用从而在许多信号通路中发挥功能。ILK与PINCH蛋白和Parvin蛋白形成三元复合物(IPP复合物),其中,ILK通过N-端ANK(ankyrin repeat)结构域与PINCH中的LIM结构域结合,通过C-端蛋白激酶结构域(kinase domain)与Parvin中的CH2结构域结合。在各种动物模型生物中的功能研究表明,ILK,PINCH和Parvin在胚胎发育中必不可少,在器官的发育过程中具有重要作用。IPP复合物在与细胞骨架动态调控密切相关的细胞运动过程中行使着重要作...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 课题背景
        1.1.1 黏着斑结构和整合素蛋白
        1.1.2 IPP蛋白质复合物及其功能
    1.2 冷冻电子显微镜学
    1.3 课题研究目的及意义
    1.4 研究内容及技术路线
        1.4.1 研究内容
        1.4.2 技术路线
第2章 实验材料与方法
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 实验仪器
        2.1.2 实验材料
        2.1.3 实验试剂的配制
        2.1.4 引物序列
    2.2 实验方法
        2.2.1 分子克隆
            2.2.1.1 质粒提取
            2.2.1.2 基因片段PCR扩增
            2.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳
            2.2.1.4 胶回收
            2.2.1.5 酶切连接
            2.2.1.6 感受态转化
            2.2.1.7 阳性菌落筛选
            2.2.1.8 测序结果比对
        2.2.2 蛋白质表达纯化
            2.2.2.1 大肠杆菌扩增及诱导表达
            2.2.2.2 昆虫细胞表达
            2.2.2.3 293E哺乳细胞表达
            2.2.2.4 细胞破碎
            2.2.2.5 镍柱亲和层析纯化
            2.2.2.6 分子筛层析纯化
            2.2.2.7 快速蛋白液相色谱
        2.2.3 SDS-PAGE
        2.2.4 免疫印迹鉴定
        2.2.5 感受态细胞制备
            2.2.5.1 DH5α细胞
            2.2.5.2 BL21和Rosetta感受态细胞制备
        2.2.6 蛋白浓缩
        2.2.7 负染制样及拍摄
            2.2.7.1 制样
            2.2.7.2 电镜拍摄
        2.2.8 冷冻电镜制样及数据收集
            2.2.8.1 冷冻制样
            2.2.8.2 图像采集
            2.2.8.3 图像加工处理
            2.2.8.4 颗粒挑选
            2.2.8.5 2D结构的信息和分类
            2.2.8.6 初始结构的计算
            2.2.8.7 结构的细化
            2.2.8.8 3D结构的分析
    2.3 本章小结
第3章 IPP复合物的表达及纯化
    3.1 实验内容
        3.1.1 表达载体设计
        3.1.2 原核表达系统
            3.1.2.1 IPP运用不同载体共表达
            3.1.2.2 IPP运用共表达载体进行共表达
            3.1.2.3 ILK的突变C346S,C422S
        3.1.3 昆虫表达系统
        3.1.4 293E细胞表达系统
        3.1.5 纯化条件的筛选
    3.2 结果与分析
    3.3 本章小结
第4章 IPPCH2复合物
    4.1 IPPCH2功能验证
    4.2 IPPCH2复合物的初步电镜结果
    4.3 本章小结
第5章 IPP复合物的初步结构生物学研究
    5.1 IPP验证
    5.2 IPP与 PXN蛋白复合物的纯化
    5.3 IPP复合物结构的初步研究
    5.4 本章小结
第6章 总结与展望
参考文献
致谢



本文编号：3807604