BAP1调控mTOR信号通路的分子机制探究

发布时间：2023-06-03 18:00

　　BAP1(BRCA1-associated protein 1)最初通过酵母双杂交被鉴定为与BRCA1(breast cancer type 1 susceptibility protein)相互作用的蛋白,编码一种核去泛素化酶。它属于核泛素羧基末端水解酶(UCH)家族,其已知底物包括组蛋白2A和BARD1。LKB1(Liver kinase B1)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞内稳态和肿瘤抑制中起重要作用。尽管对LKB1调控的AMPK-mTOR下游通路比较清楚,但LKB1上游调控机制长期以来并不清楚。本研究通过酵母双杂的方法发现LKB1和BAP1存在相互作用,并且免疫共沉淀实验在293T细胞内也验证到相互作用的存在。进一步通过泛素化实验发现BAP1去泛素化修饰LKB1,并且二者主要位于细胞核内,BAP1可增强LKB1的蛋白稳定性。在几种肺癌细胞系中BAP1与AMPK磷酸化水平具有相关性,体外磷酸化试验提示BAP1通过LKB1刺激更多的AMPK磷酸化,这提示BAP1可通过LKB1激活AMPK。同时,敲减BAP1也显示更高的S6K1磷酸化水平,S6K1是mTOR底物蛋白,这暗示BA...

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 BAP1研究概述
        1.1.1 BAP1功能及调控
        1.1.2 BAP1与疾病
    1.2 蛋白质泛素化与去泛素化
        1.2.1 蛋白质泛素化修饰概述
        1.2.2 蛋白质泛素化
        1.2.3 蛋白质去泛素化
    1.3 LKB1-AMPK-mTOR通路
        1.3.1 LKB1通路
        1.3.2 AMPK通路
        1.3.3 mTOR通路
第2章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 酵母双杂交培养基和所用试剂
            2.1.1.1 酵母培养基
            2.1.1.2 酵母双杂试剂
            2.1.1.3 酵母菌株
        2.1.2 载体构建及所用试剂
            2.1.2.1 培养基及抗生素
            2.1.2.2 载体构建所用酶类
            2.1.2.3 琼脂糖凝胶电泳试剂
            2.1.2.4 文章所用质粒列表
        2.1.3 蛋白纯化试剂
        2.1.4 蛋白电泳及免疫印迹试剂
        2.1.5 蛋白质相互作用及泛素化试剂
        2.1.6 细胞及培养试剂
        2.1.7 其他试剂
        2.1.8 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 克隆载体构建
            2.2.1.1 一般克隆载体构建
            2.2.1.2 点突变克隆载体构建
            2.2.1.3 质粒DNA的小量抽提
        2.2.2 蛋白纯化
            2.2.2.1 重组蛋白的检测
            2.2.2.2 GST标签蛋白纯化
            2.2.2.3 His标签蛋白纯化
        2.2.3 酵母双杂
        2.2.4 细胞培养
        2.2.5 免疫印迹
        2.2.6 GST Pull down
        2.2.7 免疫共沉淀(CO-IP)
        2.2.8 免疫沉淀及泛素化检测
        2.2.9 体外去泛素实验
        2.2.10 细胞免疫荧光实验
        2.2.11 逆转录病毒和慢病毒包装
        2.2.12 基于GFP competition assay系统的药物筛选
        2.2.13 实时荧光定量PCR
        2.2.14 油红O染色
        2.2.15 软琼脂实验
        2.2.16 ROS分析
        2.2.17 生物学统计学分析方法
第3章 结果
    3.1 去泛素化酶BAP1 能够与LKB1 蛋白相互作用
        3.1.1 酵母双杂发现BAP1与LKB1 相互作用
        3.1.2 BAP1和LKB1 存在直接相互作用
    3.2 BAP1 去泛素化修饰LKB1
        3.2.1 LKB1泛素化修饰
        3.2.2 BAP1 去泛素化修饰LKB1
        3.2.3 BAP1 抑制LKB1 降解
    3.3 BAP1 通过LKB1 调控AMPK-mTOR信号通路
        3.3.1 BAP1与AMPK磷酸化水平正相关
        3.3.2 BAP1 依赖LKB1 促进AMPK磷酸化
        3.3.3 BAP1敲减细胞S6K1磷酸化水平升高
        3.3.4 BAP1 敲减细胞对PP242和Lovastatin耐受
        3.3.5 BAP1 敲减细胞抑制Lovastatin所诱导的ROS积累
    3.4 BAP1敲减细胞增强脂质合成和细胞转化
        3.4.1 过表达BAP1抑制癌细胞生长
        3.4.2 敲减BAP1增强细胞转化
        3.4.3 BAP1敲减细胞脂质合成关键基因转录水平升高
        3.4.4 BAP1敲减细胞增强脂质合成
第4章 讨论
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢
附录



本文编号：3829773