天蚕素AD在毕赤酵母中的多拷贝整合表达及表达条件优化

发布时间：2024-01-17 18:02

　　【背景】天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽,实现工业化生产为其在农业、养殖业中的应用奠定了基础。【目的】获得一株高效生产天蚕素AD的基因工程菌株。【方法】构建重组载体pGAPZαA-CAD通过电击转化至PichiapastorisX33中,表达天蚕素AD基因并获得X33/GCAD菌株;构建重组载体pUCGAP-CAD导入至X33/GCAD菌株中。pGAPZαA-CAD是以博来霉素为抗性筛选标签被整合到P. pastoris X33的GAPDH启动子区域,pUCGAP-CAD是以遗传霉素为抗性筛选标签被整合到P. pastoris X33的非翻译rDNA区域,最终获得一株高效表达天蚕素AD的酵母菌株X33/GUCAD。【结果】通过质谱分析鉴定X33/GUCAD表达的抑菌物质为天蚕素AD,通过发酵条件的优化,表明X33/GUCAD菌株在以甘油为碳源和以蛋白胨、酵母提取物为有机氮源的情况下具有较强表达天蚕素AD的能力。【结论】较高的拷贝数更有利于提高天蚕素AD的产量,此工程菌株在后期发酵过程中稳定性较好,适于工业化生产。

【文章页数】：11 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和质粒
        1.1.2 主要试剂和仪器
        1.1.3 培养基
    1.2 重组菌株的表达
        1.2.1 重组表达载体pGAPZαA-CAD的构建及重组菌株X33/GCAD的表达
        1.2.2 重组表达载体pUCGAP-CAD的构建及重组菌株X33/GUCAD的表达
    1.3 实时荧光定量PCR法确定重组菌株中的基因拷贝数
    1.4 天蚕素AD的Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白电泳及质谱鉴定
    1.5 发酵条件优化
        1.5.1 不同发酵培养基的选择
        1.5.2 发酵培养基中不同碳源的选择
        1.5.3 发酵培养中氮源添加量优化
    1.6 固体抑菌试验及抗菌谱的测定
    1.7 抗菌肽生物效价的计算方法[24]
2 结果与分析
    2.1 多拷贝整合表达天蚕素AD毕赤酵母工程菌的构建
    2.2 不同转化子中天蚕素AD基因拷贝数的确定
    2.3 天蚕素AD的Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白胶及质谱图分析
    2.4 不同培养基、碳源以及氮源含量对天蚕素AD表达的影响
    2.5 抗菌谱的测定
3 讨论与结论



本文编号：3879390