细菌脂肪氧合酶酶学性质分析及表达优化

发布时间：2024-03-09 18:06

　　脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一类含有非血红素铁的双加氧酶,在食品、医药和化工等行业具有广泛应用。利用Escherichia coli BL21(DE3)重组表达来源于Pseudomonas aeruginosa和Burkholderia thailandensis的脂肪氧合酶PaLOX、BtLOX,并对其酶学性质进行比较分析。通过对酶学性质分析发现:PaLOX、BtLOX的最适反应温度分别为25和35℃;最适反应pH分别为7.0和7.5。PaLOX的K_cat/K_m较BtLOX高16.7倍,展现出更好的开发应用潜力。为优化PaLOX的可溶性表达,采取了2种优化策略:首先利用乳糖作为诱导剂代替异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),使胞内酶活力提高了1.53倍,可溶表达水平提高了2.41倍;进一步与触发因子(triggering factor,TF)融合表达,TF-PaLOX酶活力提高了1.85倍,可溶表达水平提高3.19倍。该研究通过分析细菌来源脂肪氧合酶酶学性质...

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【部分图文】：

图1LOX的系统发育树

为研究LOX的表达情况，分别在E.coliBL21(DE3)中构建表达PaLOX、BtLOX的重组质粒pET-22b(+)/Palox、pET-22b(+)/Btlox(图2-a)，并在20℃条件下诱导表达。图2构建的LOX表达质粒和Palox、Btlox表达蛋白....

图2构建的LOX表达质粒和Palox、Btlox表达蛋白SDS-PAGE电泳分析图

图1LOX的系统发育树通过蛋白表达分析发现，PaLOX、BtLOX在胞内可溶和不溶部分均有明显条带，其大小约为70kDa。而BtLOX胞外未见重组蛋白条带(图2-b)。LOX活性结果显示，PaLOX发酵上清液LOX酶活力为351U/DCW(UnitsperDr....

图3温度对LOX催化活性及稳定性的影响

为评估LOX的应用潜力，对LOX的最适反应温度和热稳定性进行了比较分析。结果表明，重组PaLOX和BtLOX的最适反应温度分别为25和35℃(图3-a)。随着反应温度的不断升高，当反应温度超过50℃时，2种来源的LOX活力均显著降低，但BtLOX活性下降较PaLOX明显。....

图4pH对LOX酶活力及稳定性的影响

对酶有激活作用的激活剂，能在酶与底物之间形成一种酶-金属离子-底物的三元复合物，有利于底物与酶的活性中心结合;而对酶活力有抑制作用的，则可作为酶的抑制剂。因此，实验研究了金属离子对2种LOX酶活力的影响(图5)。其中Mg2+和Na+对PaLOX和BtLOX有激活作用，Cu2+....

本文编号：3923734