共表达谷氨酰-tRNA还原酶增强染料脱色过氧化物酶在大肠杆菌中的表达活性

发布时间：2024-04-18 01:48

　　染料脱色过氧化物酶(dye-decoloorizing peroxidase,DyP)属于以血红素为辅基的新型过氧化物酶类,常因缺乏辅因子而导致催化活性低。将来源于褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的染料脱色过氧化物酶基因(TfuDyP)与大肠杆菌谷氨酰-tRNA还原酶基因(hemA),构建重组质粒phemA-DyP,转化至E.coli BL21中进行共表达。分别以2,2-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和顽固性染料活性蓝19(RB19)、溴酚蓝、溴甲酚绿为底物检测TfuDyP的催化活力以及染料脱色效率。结果表明,诱导后的共表达菌株pAD胞内血红素含量为9. 8μmol/L,而单独过表达基因TfuDyP的菌株pD仅为3. 4μmol/L。TfuDyP纯酶的全波长扫描分析表明,在菌株pAD中DyP酶与血红素的结合度相比pD有较大幅度的提升。pAD菌株表达的DyP酶活力较pD菌株提高了110%,酶活力的提高使其在染料脱色应用方面也得到增强。在pAD菌株培养基中分别添加谷氨酸(Glu)、FeCl₂使得胞内血红素含量、DyP酶活...

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

图1重组质粒phemA-DyP示意图

用pDyP质粒作为模板，利用上游引物5"-AAGCT-TGCGGCCGCACTCGAGTAATACGACTCACTAT-AGGG-GA-3"和下游引物5"-GTGGTGGTGGTGGTGCT-CGAGT-TAACCTTCAATCAGATCCTGACCC-3"扩增得到TfuD....

图2目的基因和重组质粒构建的凝胶电泳

以实验室保存的pDyP质粒为模板，使用特异性引物PCR扩增获取目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示与预期大小1543bp相符(图2-a)。通过同源重组酶连接到phemA质粒上，组成新的重组质粒phemA-DyP，用XhoI酶切并用琼脂糖凝胶电泳进行验证(图2-b),phem....

图3TfuDyP的SDS-PAGE电泳分析

将新构建的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，在相同条件下进行诱导表达，获得具有活性的可溶性TfuDyP,TfuDyP粗酶液经镍柱纯化和脱盐柱脱盐处理后，利用SDS-PAGE蛋白电泳检测重组蛋白纯度。如图3所示，酶纯度已到达了酶学性质分析的要求，融合蛋白理论大小约....

图4重组菌的血红素含量

将重组菌在37℃、0.3mmol/LIPTG诱导后，进行胞内血红素检测，结果如图4所示，pD菌株血红素浓度为3.4μmol/L，而共表达菌株pAD血红素浓度明显提高，达到9.8μmol/L，在菌株pAD培养基中外源添加20μmol/LFeCl2(下同)、40μmol/L谷....

本文编号：3957240