基于核酸定量的核质分离质控方案

发布时间：2024-05-07 00:13

　　目的:拟建立一种方便快捷、经济有效的细胞核质分离鉴定方法。方法:本研究从DNA水平进行核质分离鉴定,选择GAPDH、ND1分别作为细胞核和细胞质标志基因,并根据GAPDH及ND1序列保守区设计引物,基于荧光定量PCR方法定性检测核质分离的效果。随后将本鉴定方法应用于其他种类细胞(BEAS-2B细胞、GT1-7细胞)及组织(小鼠心脏、肝脏、大脑)的核质分离鉴定。结果:在293T细胞应用该鉴定方法鉴定核质分离效果,结果显示:GAPDH、ND1在核组、质组中的含量存在明显差异,其中核标志基因GAPDH在细胞核中的比例达到了95%以上,质标志基因ND1在细胞质中的比例也达到了90%左右,这与从RNA水平及蛋白水平鉴定核质分离的结果一致。在其他种类的细胞(BEAS-2B细胞、GT1-7细胞)及组织(小鼠心脏、肝脏、大脑)应用该方法结果显示:细胞核组分中质标志基因ND1含量比293T细胞的有所增加,但仍可以实现核质分离鉴定。结论:本研究所建立的核质分离质控方法可以实现从DNA水平进行核质分离的鉴定,该方法更加经济、快捷。

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【部分图文】：

在从DNA水平鉴定核质分离效果过程中，可以看出：当使用中等强度的裂解液（mRIPA）进行核质分离时，经常会出现核基因在细胞质中含量较高的现象，而当使用弱裂解液（L1和L2lysate）进行核质分离时，质基因在细胞核中的含量较高，这也是由两种裂解液自身属性决定的[22]，所以，....

图3新建立的核质分离质控方法在两种细胞中的应用在研究核质分离裂解液裂解不同时间对核质分离的影响时，本研究选择了单拷贝的GAPDH基因[23]而不是多拷贝的ND1基因，这是由于存在于细胞中的ND1含量和细胞状态密切相关，即细胞状态的微小差异就可能会对细胞中ND1含量造成很大的影响....

L2裂解液裂解不同时间对核质分离的影响见图1f。离心5min时，随着裂解时间的延长，细胞质中核基因所占的比例越来越高。至于裂解时间，由于核质分离时需要用核质分离裂解液将沉淀的细胞团块吹打均匀，这一步骤本身需要一定的时间，所以如果裂解时间太短；而裂解时间太长又会导致细胞质中核基因....

细胞所处的时期与其分裂状态密切相关[17]，若细胞处于分裂期，核仁核膜消失[18]，此时无法较好地对核质进行分离，这也是核质分离时，核质不能彻底分开的一个重要原因[9,19]。所以，本研究在进行核质分离时，细胞生长到90%以上，此时由于细胞间的接触抑制[20]，绝大多数细胞停留在....

本文编号：3966547