拟南芥SHB1与CCA1相互作用减弱植物光响应并增强其热形态建成的研究

发布时间：2024-09-29 20:31

　　植物生长发育受到多种因素的调控,其中外部因素,如光照、温度、湿度等,对其正常的生长发育具有关键作用。植物的光合作用为其生命活动提供能量,而且光照也可以作为一种输入信号引起植物体内发生相应变化,随时调控植物的生长发育状态。温度也是植物生长发育不可或缺的因子之一,在长期的进化过程中,植物体内也形成了一套复杂的感知以及响应外界温度变化的系统,可以很好地适应环境温度的升高或降低。然而,过强的光照或过激的温度变化均会对植物的生长发育带来不利影响,甚至导致其死亡。因此,探究植物如何感受外界环境的变化以及这种变化如何通过调控内在的信号传导网络以促使植物做出适应性改变,对于我们更好地改良农作物品质及增加产量具有重要的指导意义。本研究在模式植物拟南芥中开展,主要研究SHB1与CCA1/LHY形成的蛋白复合体特异性地在红光条件下调控PIF4基因的表达。PIF4(PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4)是植物光形态建成过程中关键的负调控因子之一,参与调控植物生长发育的多个方面,同时也是植物热形态建成过程中的关键因子;SHB1(SHORT HYPOCOTYL UNDER BLUE 1)...

【文章页数】：114 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 植物光形态建成
        1.1.1 植物光受体
            1.1.1.1 光敏色素
            1.1.1.2 隐花色素与向光素
            1.1.1.3 UVR
        1.1.2 光敏色素互作因子
            1.1.2.1 PIFs的结构特点
            1.1.2.2 PIF4 多方面地参与调控植物生长发育
    1.2 植物生物节律
        1.2.1 拟南芥生物钟核心振荡器的分子机制
        1.2.2 光、温信号与生物钟之间的联系
    1.3 SHB1 在植物光形态建成中的作用
    1.4 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株与质粒
        2.1.3 酶与试剂
        2.1.4 仪器设备
        2.1.5 引物
    2.2 实验方法
        2.2.1 各种培养基配方
        2.2.2 植物材料的生长
            2.2.2.1 拟南芥种子消毒处理及萌发
            2.2.2.2 拟南芥植物的正常生长
            2.2.2.3 拟南芥植物的高温条件处理
            2.2.2.4 拟南芥幼苗下胚轴长度的测量
        2.2.3 构建拟南芥转基因植物
            2.2.3.1 植物基因组DNA的提取(SDS法)
            2.2.3.2 PCR扩增目的基因片段
            2.2.3.3 目的片段的回收(试剂盒法)
            2.2.3.4 TOPO TA连接反应
            2.2.3.5 大肠杆菌感受态的制备及转化(电转法)
            2.2.3.6 PCR筛选方向及质粒提取(试剂盒法)
            2.2.3.7 LR反应
            2.2.3.8 PCR鉴定阳性菌
            2.2.3.9 农杆菌GV3101 感受态的制备与转化(电转法)
            2.2.3.10 浸花法转化拟南芥植物
        2.2.4 双、三突变体的构建及鉴定
            2.2.4.1 拟南芥植物的杂交
            2.2.4.2 PCR鉴定纯合突变体
        2.2.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
            2.2.5.1 植物总RNA的提取(试剂盒法)
            2.2.5.2 反转录
            2.2.5.3 qRT-PCR的引物设计及合成
            2.2.5.4 qRT-PCR的反应体系及结果分析
        2.2.6 染色质免疫共沉淀分析(ChIP)
            2.2.6.1 染色体与蛋白交联
            2.2.6.2 染色体准备(4°C)
            2.2.6.3 免疫共沉淀(4°C)
            2.2.6.4 洗脱与解交联
            2.2.6.5 沉淀DNA
        2.2.7 免疫共沉淀分析(Co-IP)
            2.2.7.1 植物总蛋白的提取
            2.2.7.2 免疫共沉淀
            2.2.7.3 Western blot
        2.2.8 酵母单杂交(Y1H)
            2.2.8.1 pAbAi-Bait质粒的构建及线性化
            2.2.8.2 Y1H酵母感受态细胞的制备
            2.2.8.3 酵母菌的转化及阳性克隆的筛选
            2.2.8.4 pAbAi-Bait酵母菌株的AbA抗性检测
            2.2.8.5 制备含有pAbAi-Bait质粒的酵母感受态细胞以及不同GAD质粒的转化
        2.2.9 双分子荧光互补分析(BiFC)
            2.2.9.1 烟草转化
        2.2.10 双分子荧光素酶活性分析
            2.2.10.1 拟南芥叶片原生质体的提取与转化
            2.2.10.2 LUC/REN活性检测
3 结果与分析
    3.1 SHB1、CCA1/LHY特异性地在红光条件下调控PIF4 的表达
        3.1.1 SHB1 在红光条件下特异性地诱导PIF4 基因表达
        3.1.2 SHB1 在红光条件下促进PIF4 蛋白积累
        3.1.3 CCA1、LHY参与调控PIF4 基因表达
    3.2 SHB1、CCA1、LHY与 PIF4 的遗传关系鉴定
    3.3 SHB1与CCA1/LHY上调PIF4 基因表达可增强植物的热形态建成
    3.4 SHB1 通过CCA1/LHY关联至PIF4 基因启动子区域
        3.4.1 SHB1 在红光条件下与PIF4 基因启动子相关联
        3.4.2 CCA1/LHY在红光条件下可结合至PIF4 基因启动子
        3.4.3 CCA1/LHY在黑暗条件下无法结合PIF4 基因启动子
        3.4.4 SHB1与CCA1/LHY结合PIF4 基因启动子符合PIF4 基因的节律表达模式
    3.5 CCA1/LHY可直接结合至PIF4 基因启动子中的M1 元件
    3.6 SHB1与CCA1/LHY相互作用
    3.7 SHB1 N端与CCA1/LHY C端互作
    3.8 CCA1/LHY与 SHB1 共同作用于PIF
4 讨论
    4.1 SHB1 通过上调PIF4 表达有助于维持植物光形态建成的动态平衡
    4.2 SHB1 特异性地调控PIF4 基因的表达
    4.3 PIF4 蛋白水平与转录水平具有一致的节律表达模式
    4.4 CCA1/LHY在黑暗条件下无法结合至PIF4 基因启动子
    4.5 SHB1-CCA1/LHY复合体结合PIF4 基因启动子符合其节律表达模式
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况



本文编号：4006294