基于超声波预处理的麦胚ACE抑制肽酶法制备技术研究

发布时间：2019-05-07 12:24

【摘要】：麦胚蛋白作为面粉加工中的副产物而未被充分利用,本文旨在通过超声波预处理制备麦胚蛋白ACE抑制肽,以提高其附加值。研究了不同模式超声波处理后,麦胚蛋白溶解度、紫外光谱、荧光光谱和巯基、二硫键含量等的变化,探寻经超声波处理后蛋白被酶解生成高活性ACE抑制肽的原因；通过红外光谱定量分析蛋白二级结构含量的变化,建立酶解液ACE抑制率与二级结构相对含量之间的关系；通过测定超声波处理后反应热动力学参数,证明超声波预处理对麦胚蛋白结构的变化促使酶解反应易于进行；对聚能式超声预处理麦胚蛋白的酶解工艺进行了优化,并通过建立酶膜耦合系统进行生产制备,提高蛋白转化率并延长持续工作时间；最后,对制备得到的麦胚ACE抑制肽进行体外稳定性试验以及动物体内试验,验证所得产物具有良好的体外稳定和体内降压效果。主要研究结论如下： (1)麦胚分离蛋白具有良好的溶解性,经过聚能探头式超声波和平板式超声波处理后,在绝大部分参数处理下其溶解度有不同程度降低,因而蛋白的可降解性与其溶解度之间可能并无直接关系。 (2)麦胚蛋白紫外、荧光发射光谱的变化表明超声波改变了蛋白的结构,而处理后普遍表现出荧光猝灭现象,说明超声波使麦胚蛋白多肽链发生了不同程度的伸展；麦胚蛋白ANS荧光光谱的变化,证明超声波引起蛋白内部疏水性氨基酸外露；蛋白分子中二硫键含量的减少和巯基含量的增加,表明超声作用促使麦胚蛋白多肽链伸展,有利于麦胚蛋白内部疏水性基团与酶的接触,从而产生高活性的ACE抑制肽,并且当二硫键与巯基含量变化较大时,酶解液的ACE抑制率较高。 (3)通过比较分析超声波处理后麦胚蛋白的FT-IR,发现其二级结构相对含量发生不同方向变化。超声波作用使p-折叠相对含量降低而p-转角相对含量增加,表明麦胚蛋白结构在超声波作用下由紧密变的疏松,从而有利于酶解释放出更多高活性的ACE抑制肽；而α-螺旋结构的相对含量变化与酶解液的抑制效果呈负相关,无规则卷曲则因自身结构特性而保持相对稳定。 (4)聚能探头式超声波和平板式超声波预处理后,并不能引起麦胚蛋白水解度的改变,但在不同程度上改变酶解液的ACE抑制率。聚能探头式超声波处理麦胚蛋白后,其酶解液的抑制率均得到提高,特别是当超声功率为600W时,酶解液的ACE抑制率为69.44%,与未经超声处理的对照组相比,抑制活性提高了1.95倍。而平板式超声波处理后,对酶解液ACE抑制率影响复杂：对单板超声波预处理,在较低的频率下(≤30kHz),固定超声频率有利于超声作用后酶解液抑制率的提高,而在较高的频率(≥40kHz)时,扫频则更有利于麦胚蛋白酶解液释放出更多的ACE抑制肽；双板在固定频率组合为24kHz和68kHz时,其酶解液的ACE抑制率最高为65.5%,比未超声对照组相比提高了1.57倍,接近于聚能探头式超声处理时的效果。而双板在扫频时,不仅抑制活性相对较低并且出现酶解液抑制活性降低的现象。因此对于双板超声波固定双板的频率更有利于麦胚蛋白高活性ACE抑制肽的释放。 (5)超声波预处理影响麦胚蛋白的酶解热力学参数。聚能探头式超声波和双板定频式超声波分别使麦胚蛋白的Ea从34.26 kJ/mol降到10.76、和12.86 kJ/mol;使△H从31.70 kJ/mol降到8.21和10.31 kJ/mol;使AS从-209.9 J/mol-K降到-281.92和-275.36 J/mol-K;使△G从96.38 kJ/mol降到95.08和95.16 kJ/mol。因此,两种超声波预处理均有利于麦胚蛋白酶解催化反应的进行,使酶解反应更容易,且聚能式超声更能降低麦胚蛋白酶解反应所需要的能量,更有利于促进蛋白酶解反应的进行。 (6)基于单因素试验的基础,用响应面试验设计的方法对聚能式超声波处理后麦胚蛋白的酶解工艺进行优化,最终确定最优条件为：底物质量浓度为1.2%、加酶量[E/S]为2.2%和酶解时间为88min。该条件下酶解液IC50值为0.72mg/ml (7)选用5kDa的膜器进行酶膜耦合制备麦胚ACE抑制肽研究,通过连续补料试验,发现此酶膜反应器的制备ACE抑制肽的底物蛋白的转化率为55.3%,较传统提高36.17%,IC50值为0.50mg/ml,降低了30.6%。 (8)麦胚ACE抑制肽性能试验研究表明,麦胚ACE抑制肽具有较好的酸、热稳定性和抗肠道酶消化能力,并对SHR具有明显的降血压作用。但在生产及贮藏过程中应尽量避免暴露于高温及强碱条件。
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【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：TS201.2

【参考文献】