酪蛋白非磷肽酶膜耦合法制备ACE抑制肽

发布时间：2020-02-09 23:06

【摘要】：酪蛋白磷酸肽(CPPs)是具有结合矿物质作用的活性肽,人们对它的研究开发较早,已经实现工业化生产,但是伴随其生产产生的副产物CNPPs未得到足够的重视和研究开发。由于CNPPs中的疏水性氨基酸含量较高,是ACE抑制肽的良好来源,特别是肽段相对分子质量小、含有特定疏水性氨基酸时具有较高的ACE抑制活性,因此本研究采用酶膜耦合法处理CNPPs制备ACE抑制肽,通过对CNPPs的控制水解,制备和分离相对分子质量较小的酶解产物,循环利用水解酶,建立一种制备ACE抑制肽的新方法。首先,对CNPPs的氨基酸组成和相对分子质量分布进行测定,结果表明,CNPPs疏水性氨基酸的摩尔百分比和疏水性值分别为54.67%和7.47,相对分子质量大于1500Da的肽占相当大一部分比例。CNPPs经1K膜超滤分离后,相对分子质量小于1K Da滤过液的ACE抑制率为50.40%,远高于相对分子质量大于1K Da的肽的ACE抑制率18.82%。结合CNPPs和ACE抑制肽的组成和结构特点,有对CNPPs进一步研究的必要。然后,对CNPPs酶膜耦合法制备ACE抑制肽水解用酶进行筛选。对几种蛋白酶制备的ACE抑制肽的抑制活性、得率和酶活力保留率的测定结果表明,Protease N制备ACE抑制肽的抑制率大于55%,酶活力保留率大于90%,优于其它几种蛋白酶。ACE抑制肽得率较高,仅次于AS1398中性蛋白酶。综合考虑,Protease N是适合酶膜耦合法制备ACE抑制肽的水解用酶。接着研究了CNPPs酶膜耦合反应的条件。以ACE抑制肽得率和酶残余活力为指标,确定了各反应条件对CNPPs酶膜耦合反应影响的主次顺序为:压力进料速度温度加酶量。最后得出CNPPs酶膜耦合反应较佳条件为:压力12psi,进料速度145mL/min,温度47.5℃,加酶量6000 U/g蛋白质。在此优化条件下对CNPPs酶膜耦合反应,达稳定状态后,滤液肽浓度为2.5mg/mL,膜通量为50mL·min~(-1)·m~(-2),反应器中肽浓度为5.7 mg/mL,蛋白酶活力每小时下降8%左右。最后对ACE抑制肽进行脱盐并对产品性质进行测定。大量无机盐的存在使ACE抑制肽的品质受到影响,本文选择DA201-C大孔吸附树脂可以完全脱除ACE抑制肽中的盐分。用85%(v/v)乙醇静态解吸,蛋白质回收率大于85%,所得ACE抑制肽脱盐率大于95%。IC50值由脱盐前0.86mg/mL降到脱盐后0.12mg/mL。经体外消化稳定性实验发现ACE抑制肽具有稳定性。
【图文】：

马尿酸,图谱,疏水性

马尿酸的生成量可以通过 RP-HPLC 图谱定量测定，如图 2-1 所示，马尿酸的洗脱峰峰面积与马尿酸的浓度成很好的线性关系。图2-2 马尿酸的RP-HPLC图谱Fig.2-2 Chromatograms of Hippuric acid on RP-HPLC由马尿酸的 RP-HPLC 图 2-2 可知，，马尿酸与其他物质可以完全分开，则用 RP-HPLC法可以准确测定马尿酸的量。2.4 结果与讨论2.4.1 CNPPs 的氨基酸组成及疏水性值CNPPs 的氨基酸组成和疏水性值见表 2-1。CNPPs 疏水性氨基酸的摩尔百分比和疏水性值分别为 54.67%和 7.47。CNPPs 中疏水性氨基酸比例较高，这说明制备的 CNPPs具有较强的疏水性。测定结果符合预期的判定，酪蛋白中的疏水性氨基酸主要集中在酪

图谱,洗脱体积

有时洗脱体积会大于“床体积”。严格来说，这种现象是不般原理，如有些芳香族物质、杂环类化合物、酚类物质等的洗脱体积体积”，这种情况对于凝胶层析机理的解释会造成一些偏差，然而并不[67]。具有设备简单、操作方便、条件温和、重复性好和样品回收率高等优点Ps 的相对分子质量分布的情况，我们采用凝胶过滤色谱对其进行分离分离的混合肽中相对分子质量小于 1500Da 的组分占很大比例，因而 1500Da 的 Sephadex G-15 对其进行分离。 Sephadex G-15 对 CNPPs 的分离图谱，由图谱及凝胶色谱原理可知，1/2 柱体积（即相对分子量大于 1500Da）的洗脱峰面积大于洗脱体积即相对分子质量大于 1500Da）的洗脱峰面积，所以 CNPPs 中相对分Da 的肽所占比例较相对分子量大于 1500Da 肽的比例略大。由于相对ACE 抑制肽的活性有影响，CNPPs 中相对分子质量较大的肽也占有相，所以有对其进行进一步的研究必要。.4
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：TQ464.7

【参考文献】