链状亚历山大藻microRNA高通量测序及生物信息学分析

发布时间：2017-10-29 16:19

  本文关键词：链状亚历山大藻microRNA高通量测序及生物信息学分析

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【摘要】：microRNA (Micro ribonucleic acids, miRNAs)是真核生物中普遍存在的一类长约19-25 nt的内源性非编码小RNA,能够在转录后水平调控靶基因的表达。作为一类表达具有时序性和组织特异性的进化上相对保守的调节者,microRNA在生物体的许多生理代谢过程中都发挥着重要的调节作用,如细胞增殖、器官发育、信号转导和响应胁迫等。赤潮是一种全球性的生态异常现象和自然灾害,给人类生产、生活和生态环境都来了严重的损害。随着海洋环境污染的逐渐加重,赤潮的发生次数、危害面积及带来的损害越来越大,因此,全球的研究者都为赤潮的发生机理和防治付出了很多的努力。甲藻是一类重要的赤潮生物,研究者已在生理生态方面对甲藻做了很多研究,但赤潮生物爆发性增殖的分子机理研究的相对较少。链状亚历山大藻是一种全球分布的能产生麻痹性贝毒毒素的典型甲藻,本文利用高通量测序技术对该藻延迟期和对数期两个文库进行了测序,共得到38,092,056和32,969,156条raw reads,发现88个已知的microRNA,可归为32个家族,得到15个新颖的microRNA以及83个microRNA前体。其中在两个不同的生长时期有12差异表达的microRNA。通过12个差异表达microRNA的靶基因预测,我们共得到了1813个靶基因,并对其进行了GO注释和KEGG功能注释。osa-miR2876、rgl-miR5139、aca-miR-3p-456915和ae-miR159a均参与DNA复制或细胞快速生长代谢相关的途径的调控,如：细胞周期,嘌呤、嘧啶的代谢,错配修复等。同时rgl-miR5139与藻细胞的吞噬作用相关,也为甲藻的兼性营养能力提供了证据。此外,从链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)延迟期、对数期两个小RNA文库中选择了四个差异表达的与该藻快速生长调控相关的microRNA (osa-miR2876、rgl-miR5139、aca-miR-3p-456915和ae-miR159a),设计f/2培养下延迟期、对数期和高氮、高磷、高锰对数期五个条件,以5.8srRNA为内参基因,以SYBR Green I为荧光染料,用加尾法荧光定量PCR对其相对表达量进行了检测。结果表明：osa-miR2876、rgl-miR5139、aca-miR456915-3p均在延迟期有最高的表达量,osa-miR2876、rgl-miR5139在延迟期的表达量显著高于f/2对数期和诱导对数期,与高通量测序结果是一致的；aca-miR456915-3p在延迟期的表达量与f/2对数期的表达量相当,高通量测序得到的延迟期的表达量是对数期的1.21倍,实验结果与测序结果基本一致。tae-miR159a在对数期及诱导对数期的表达量均显著高于延迟期,这与测序结果是一致的。通过对microRNA数据中得到的与该藻生长调控相关的四个microRNA进行克隆测序,确定了序列信息的正确性。并通过设置不同的培养条件,对其表达进行分析,进一步证明了microRNA在甲藻中的表达以及在链状亚历山大藻中的调控作用,也为赤潮甲藻爆发性增殖的分子机理研究奠定了基础。
【关键词】：链状亚历山大藻 microRNA 高通量测序 qPCR
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q949.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文献综述13-37
• 1. 赤潮研究概况13-21
• 1.1 赤潮的发生及其危害13-15
• 1.2 赤潮的发生与甲藻的关系15-17
• 1.3 赤潮爆发机理的生理生态及分子生物学研究现状17-21
• 2. microRNA研究进展21-30
• 2.1 microRNA的起源及加工21-24
• 2.2 microRNA的特征24-25
• 2.3 microRNA的调控机制25-26
• 2.4 microRNA在植物中的调节作用26-28
• 2.5 microRNA的分离及鉴定方法28-29
• 2.6 检测及定量分析microRNA表达的方法29-30
• 3. microRNA高通量测序及荧光定量技术30-36
• 3.1 测序技术的发展30
• 3.2 microRNA高通量测序技术30-32
• 3.3 microRNA高通量测序技术在藻类中的应用32-33
• 3.4 microRNA荧光定量PCR技术33-36
• 4. 本研究的目标和意义36-37
• 第二章 链状亚历山大藻microRNA的高通量测序及结果分析37-60
• 1. 前言37
• 2. 材料和方法37-44
• 2.1 藻种的来源及培养37-38
• 2.2 实验所需的试剂及仪器38-39
• 2.3 链状亚历山大藻的培养和藻细胞的收集39
• 2.4 总RNA的提取及质量检测39-41
• 2.5 小RNA文库的构建41
• 2.6 数据过滤及基础分析流程41-42
• 2.7 差异表达microRNA的靶基因预测及功能注释42-44
• 3. 结果44-56
• 3.1 小RNA文库的测序结果44-45
• 3.2 小RNA长度分布45-46
• 3.3 链状业历山大藻中保守microRNA的鉴定和分析46-52
• 3.4 链状亚历山大藻中新颖的microRNA52-53
• 3.5 链状亚历山大藻不同生长时期差异表达的microRNA53-54
• 3.6 差异表达的microRNA的靶基因预测及其功能注释54-56
• 4. 讨论56-59
• 4.1 链状亚历山大藻中小RNA长度分布模式56-57
• 4.2 已知micoRNA在链状亚历山大藻不同生长时期的调控作用57-58
• 4.3 差异表达的micoRNA在链状亚历山大藻不同生长时期的调控作用58-59
• 5. 小结59-60
• 第三章 链状亚历山大藻差异表达的microRNA在不同生长时期和生长状态下的qPCR验证60-71
• 1. 前言60
• 2. 实验所需的材料、试剂及仪器60-61
• 2.1 实验材料60
• 2.2 实验试剂60-61
• 2.3 实验仪器61
• 3. 实验方法61-63
• 3.1 链状亚历山大藻的培养和收集61
• 3.2 引物设计61-62
• 3.3 样本的RNA提取及反转录62
• 3.4 目的序列的回收和克隆测序62
• 3.5 qPCR溶解曲线和标准曲线的制作62-63
• 3.6 qPCR检测基因的差异表达63
• 4. 结果与分析讨论63-68
• 4.1 一链合成效率的检测63-64
• 4.2 质粒的检测64-65
• 4.3 目的基因溶解曲线和标准曲线的制作65-67
• 4.4 四个差异miRNA表达量的变化67-68
• 5. 讨论68-70
• 6. 小结70-71
• 参考文献71-85
• 致谢85-86
• 附录86-88

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本文编号：1113747