MCF-7的滚瓶培养及软骨多糖诱导其凋亡的作用研究
发布时间：2020-10-23 16:45
本文以人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象,在小瓶培养的基础上,对MCF-7进行规模放大培养,建立了MCF-7的滚瓶培养方法,然后研究了软骨多糖对MCF-7的诱导凋亡作用及其作用机理。本研究首先以滚瓶转速为变量,通过单因素试验确定了MCF-7滚瓶培养的滚瓶初期转速范围和贴壁后转速范围。然后以接种量、培养液添加量和培养时间为自变量,进行了三因素三水平的正交试验,通过分析得出对细胞产量影响极显著的因素为接种量和培养时间,根据正交试验的结果确定了滚瓶培养MCF-7的最佳方案为初期转速15r/h,贴壁后转速40r/h,接种量为5×107个细胞,培养时间96h,培养基用量150mL。在确立了MCF-7的滚瓶培养方法后,研究了软骨多糖对滚瓶培养MCF-7细胞的凋亡作用。Hochest33342/PI双染色、Annexin V-FITC/PI 和 DNA Ladder等实验结果都表明MCF-7细胞在软骨多糖作用后出现典型的凋亡现象。通过流式细胞仪检测发现在软骨多糖作用12h,24h的MCF-7凋亡率分别为20.23%和44.7%；同时发现MCF-7细胞在软骨多糖作用后,细胞周期被阻滞在了S期。通过二维电泳技术分析了正常MCF-7细胞和与软骨多糖共培养MCF-7细胞的全蛋白图谱,发现10个具有表达差异的蛋白点,其中7个蛋白点的表达量下调,3个蛋白点表达量上调。选取其中表达差异最显著的3个蛋白点,通过MALDI-TOF-MS/MS进行鉴定,共鉴定出2个差异表达蛋白,其中一个为肌动蛋白actin,其表达下调诱导线粒体凋亡途径,另一个为抗氧化类蛋白PRDX6,其表达降低,导致细胞发生氧化损伤凋亡。
【学位单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q813;R737.9
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
1.1 细胞培养技术及应用
1.1.1 动物细胞培养技术概述
1.1.2 细胞培养技术在抗肿瘤研究中的应用
1.2 乳腺癌概述
1.2.1 乳腺癌发展及现状
1.2.2 乳腺癌的发病机制及治疗
1.3 多糖概述
1.3.1 多糖的分类
1.3.2 多糖的活性
1.4 细胞凋亡概述
1.4.1 细胞凋亡的特征
1.4.2 细胞凋亡的作用机理及调控
1.4.3 研究细胞凋亡应用于乳腺癌治疗的展望
1.5 蛋白质组学在细胞凋亡研究中的应用
1.5.1 蛋白质组学的概念
1.5.2 蛋白质组学相关技术及在细胞调亡研究中的应用
1.6 本课题的研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 主要试剂及药品
2.1.2 实验仪器与设备
2.1.3 实验细胞及软骨多糖制备
2.2 实验方法
2.2.1 MCF-7细胞系的维持
2.2.2 MCF-7细胞滚瓶培养条件的研究
2.2.3 MCF-7细胞与软骨多糖在滚瓶中共培养
2.2.4 转瓶细胞观察台对MCF-7细胞形态的观察
2.2.5 Hoechst33342/PI双染检测软骨多糖对滚瓶培养的MCF-7的凋亡作用
2.2.6 Annexin V-FITC/PI染检测软骨多糖对滚瓶培养MCF-7的凋亡作用
2.2.7 DNA Ladder法检测软骨多糖对滚瓶培养的MCF-7的凋亡作用
2.2.8 流式细胞术分析软骨多糖对滚瓶培养的MCF-7细胞周期的影响
2.2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）比较MCF-7蛋白差异
2.2.10 利用双向电泳结合MALDI-TOF分析MCF-7凋亡前后差异蛋白
3 结果与讨论
3.1 MCF-7细胞的滚瓶培养条件
3.1.1 转速范围
3.1.2 培养时间
3.1.3 培养液用量
3.1.4 正交法优化培养条件
3.2 转瓶细胞观察台观察软骨多糖对MCF-7的作用
3.3 Hoechst33342/PI双染色检测MCF-7的凋亡作用
3.4 Annexin V FITC-PI对MCF-7的凋亡检测结果
3.5 凋亡细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果
3.6 流式细胞术测定MCF-7细胞周期结果
3.7 SDS-PAGE分析MCF-7凋亡前后蛋白
3.8 二维电泳结合MALDI-TOF-MS/MS分析结果
3.8.1 二维电泳结果
3.8.2 差异表达蛋白MADI-TOF-MS/MS质谱分析结果
4 结论
5 展望
6 参考文献
7 致谢
【相似文献】
本文编号：2853284
【学位单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q813;R737.9
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
1.1 细胞培养技术及应用
1.1.1 动物细胞培养技术概述
1.1.2 细胞培养技术在抗肿瘤研究中的应用
1.2 乳腺癌概述
1.2.1 乳腺癌发展及现状
1.2.2 乳腺癌的发病机制及治疗
1.3 多糖概述
1.3.1 多糖的分类
1.3.2 多糖的活性
1.4 细胞凋亡概述
1.4.1 细胞凋亡的特征
1.4.2 细胞凋亡的作用机理及调控
1.4.3 研究细胞凋亡应用于乳腺癌治疗的展望
1.5 蛋白质组学在细胞凋亡研究中的应用
1.5.1 蛋白质组学的概念
1.5.2 蛋白质组学相关技术及在细胞调亡研究中的应用
1.6 本课题的研究目的与意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 主要试剂及药品
2.1.2 实验仪器与设备
2.1.3 实验细胞及软骨多糖制备
2.2 实验方法
2.2.1 MCF-7细胞系的维持
2.2.2 MCF-7细胞滚瓶培养条件的研究
2.2.3 MCF-7细胞与软骨多糖在滚瓶中共培养
2.2.4 转瓶细胞观察台对MCF-7细胞形态的观察
2.2.5 Hoechst33342/PI双染检测软骨多糖对滚瓶培养的MCF-7的凋亡作用
2.2.6 Annexin V-FITC/PI染检测软骨多糖对滚瓶培养MCF-7的凋亡作用
2.2.7 DNA Ladder法检测软骨多糖对滚瓶培养的MCF-7的凋亡作用
2.2.8 流式细胞术分析软骨多糖对滚瓶培养的MCF-7细胞周期的影响
2.2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）比较MCF-7蛋白差异
2.2.10 利用双向电泳结合MALDI-TOF分析MCF-7凋亡前后差异蛋白
3 结果与讨论
3.1 MCF-7细胞的滚瓶培养条件
3.1.1 转速范围
3.1.2 培养时间
3.1.3 培养液用量
3.1.4 正交法优化培养条件
3.2 转瓶细胞观察台观察软骨多糖对MCF-7的作用
3.3 Hoechst33342/PI双染色检测MCF-7的凋亡作用
3.4 Annexin V FITC-PI对MCF-7的凋亡检测结果
3.5 凋亡细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果
3.6 流式细胞术测定MCF-7细胞周期结果
3.7 SDS-PAGE分析MCF-7凋亡前后蛋白
3.8 二维电泳结合MALDI-TOF-MS/MS分析结果
3.8.1 二维电泳结果
3.8.2 差异表达蛋白MADI-TOF-MS/MS质谱分析结果
4 结论
5 展望
6 参考文献
7 致谢
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1 魏欣;MCF-7的滚瓶培养及软骨多糖诱导其凋亡的作用研究[D];天津科技大学;2015年
本文编号：2853284
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