兔瘟病毒VP60基因重组真核质粒的构建及其免疫原性

发布时间：2020-10-24 12:17

　　 兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)即兔瘟,由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的一种烈性病毒病,特点是主要脏器出血,急性一般2-3天死亡,3月龄以上家兔发病率达90-100%,病死率高达95%。1984年兔瘟在我国江苏无锡、江阴等地首次发生,快速发展到我国大部分地区,并逐步蔓延到世界各个国家,给家兔养殖业造成极大危害。由于抗生素对兔瘟治疗无效,干扰素免疫调节增效作用不能彻底治愈兔瘟,目前,对兔瘟的控制以免疫预防为主,常用的疫苗是组织灭活疫苗,虽然组织灭活疫苗在控制兔瘟上发挥了重要的作用,但这种传统疫苗存在成本高,易散毒、不易保存等缺点。相比传统疫苗,基因疫苗具有安全性更高、成本更低等优点。本实验从兔瘟病毒四川株(Y8504)克隆VP60基因构建重组真核质粒,并对其免疫原性进行了研究,以期为兔瘟基因疫苗的研制奠定基础。依据GenBank上公布的RHDV的VP60序列设计特异性引物,使用RT-PCR扩增RHDV的VP60基因,片段大小为1740bp,将得到的产物经纯化后克隆到pMD19-T载体,获取重组质粒pMD19-T-VP60,并序列测定。将测序无误的pMD19-T-VP60经EcoR I与Xho I双酶切后,将目的基因VP60插入真核表达载体pVAX-1,构建真核表达质粒pVAXl-VP60。将构建好的重组质粒pVAXl-VP60按500μ.g/只腿部肌肉注射25日龄家兔,同时设pVAX-1组、兔瘟组织灭活苗组和PBS组。于免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d对各组兔静脉采血,使用ELISA法检测血清中特异性抗体,PBS组和pVAX-1组未检测到特异性抗体,pVAX1-VP60组和兔瘟组织灭活苗组家兔都能产生高水平的特异性抗体,在特异性抗体水平高峰期,两个实验组血清抗体水平差异不显著(p0.05)。在免疫后3d,7d,14d,21d,28d,35d,42d对pVAXl-VP60组随机处死3只,取心,肝,脾,肺,肾,肌肉组织,进行质粒在组织内分布的PCR检测,结果发现各组织均有基因VP60的分布。免疫后28天以滴度108的RHDV 0.5mL/只腿部肌肉注射攻毒,pVAX-1组、PBS组、兔瘟组织灭活苗组、pVAX1-VP60组的相对保护率分别为0%、0%、90%、85%,表明pVAX1-VP60具有良好的免疫效果。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.65
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 兔瘟概况
        1.1 流行病学特点
        1.2 临床症状及病理变化
            1.2.1 临床症状
            1.2.2 病理特点
            1.2.3 组织病理
    2 RHDV基因组与基因工程疫苗
        2.1 RHDV基因组
        2.2 兔瘟基因工程亚单位疫苗及病毒活载体疫苗
            2.2.1 大肠杆菌表达系统
            2.2.2 昆虫细胞杆状病毒系统
            2.2.3 酵母表达系统
            2.2.4 植物表达系统
            2.2.5 重组病毒表达系统
        2.3 核酸疫苗发展概况
            2.3.1 核酸疫苗的概念
            2.3.2 核酸疫苗的作用机理
            2.3.3 DNA疫苗的结构
            2.3.4 真核表达载体pVAX-1
            2.3.5 核酸疫苗的优缺点
    3 质粒组织分布
    4 研究目的及意义
第二章 兔瘟病毒四川株（Y8504）的分离鉴定
    1 材料
        1.1 试剂
        1.2 主要仪器
        1.3 实验动物
    2 方法
        2.1 临床症状及病理剖解
        2.2 毒株PCR检测
            2.2.1 引物设计
            2.2.2 RNA提取
            2.2.3 RNA反转录
            2.2.4 PCR扩增目的基因
        2.3 PCR扩增产物序列分析
    3 结果
        3.1 临床症状与剖解变化
        3.2 目的基因的RT-PCR扩增与鉴定
        3.3 PCR扩增产物序列分析
    4 讨论
第三章 兔瘟病毒VP60基因重组真核质粒的构建
    1 材料
        1.1 毒株与载体
        1.2 试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 培养基
    2 方法
        2.1 目的基因获取
            2.1.1 引物设计
            2.1.2 RNA提取
            2.1.3 反转录
            2.1.4 PCR扩增VP60
            2.1.5 胶回收
        2.2 pMD19-T-VP60质粒的构建
            2.2.1 感受态细胞制备
            2.2.2 目的基因的T/A连接及转化
            2.2.3 pMD19-T-VP60质粒抽提和酶切检测
            2.2.4 pMD19-T-VP60双酶切
        2.3 真核表达质粒pVAXl-VP60的构建
            2.3.1 感受态细胞制备
            2.3.2 连接转化
            2.3.3 pVAXl-VP60质粒抽提和酶切检测
    3 结果
        3.1 VP60基因的RT-PCR扩增与鉴定
        3.2 重组质粒pMD19-T-VP60的构建与鉴定
        3.3 真核表达质粒pVAX1-VP60的构建与鉴定
    4 讨论
第四章 兔瘟病毒VP60基因真核质粒免疫性研究
    1 材料
        1.1 重组真核表达质粒与载体
        1.2 试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 培养基
        1.5 实验动物
    2 方法
        2.1 重组质粒pVAX1-VP60的大量制备
        2.2 重组质粒pVAX1-VP60免疫家兔及抗体检测
            2.2.1 实验分组
            2.2.2 重组质粒pVAX1-VP60免疫家兔后血清制备
            2.2.3 抗体检测原理
            2.2.4 重组质粒免疫家兔后的抗体检测
        2.3 重组质粒pVAXl-VP60在兔体内分布检测
            2.3.1 免疫后采样
            2.3.2 DNA提取
            2.3.3 重组质粒pVAX1-VP60的PCR检测
        2.4 免疫保护率
            2.4.1 红细胞凝集实验（HA）
            2.4.2 攻毒实验
    3 结果
        3.1 重组质粒pVAX1-VP60免疫家兔特异性抗体检测
        3.2 重组质粒pVAXl-VP60免疫家兔后组织分布
        3.3 攻毒实验
    4 讨论
结论
参考文献（References）
致谢
作者攻读硕士学位期间发表的学术论文

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本文编号：2854453