Bradymonas sediminis FA350~T捕食作用对微生物群落结构的影响及遗传操作体系的建立

发布时间：2020-10-29 12:59

　　 海洋作为地球上最大的生境,蕴含的微生物资源对维持海洋中的各种生物及非生物活动具有重要的影响。海洋细菌受到多种因素的调控,微捕食者(原生生物,噬菌体和捕食性细菌)可能是影响海洋细菌组成重要的生物调控因素。噬菌体侵染和原生生物捕食被认为是海洋微生物群落构建的生物调节驱动力,近来的研究表明捕食性细菌也可能是调控海洋微生物组成的因素之一,探究捕食性细菌对海洋微生物的影响可能有助于更好的理解海洋微生物的群落演化进程。本文通过微宇宙技术探究了海洋捕食性细菌Bradymonas sediminis FA350T对于海洋沉积物微生物群落的影响。PCoA结果显示,微宇宙实验过程微生物群落的演化主要分为三个时期,实验前期(0-3d),中期(3-7d)和后期(7-14 d)。实验前期和中期,微生物群落组成差异不明显。实验后期,B.sediminis FA350T对微生物的群落结构开始显现。物种组成分析结果显示,B.sediminis FA350T 的加入导致Flavobacteriales,Rhizobiales 等类群丰度降低,Vibrionales,Alteromonadales等类群丰度显著升高。细菌共现网络分析结果显示,B.sediminis FA350T改变了微生物间的共现模式。这些结果表明,B.sediminis FA350T对微生物群落可能具有重要的调控作用。依托山东省海洋微生物菌种资源平台,本研究挑选了 15株Flavobacteriales细菌来进一步探究微宇宙实验过程中显著减少的Flavobacteriales类群是否是由于B.sediminis FA350T的捕食作用引起的。实验结果表明,B.sediminis FA350T能够捕食86.7%的Flavobacteriales。同时,本实验通过RT-PCR绝对定量的方法评估了B.sediminis FA350T对Flavobacteriales的捕食潜力,结果显示猎物菌存活率约为0.1%,表明B.sediminis FA350T对Flavobacteriales具有较高的捕食潜力。本文尝试通过同源重组或插入突变的方式筛选捕食缺陷型突变体来探索B.sediminis FA350T的捕食机制。本文确定了适合B.sediminisFA350T的抗生素筛选浓度和电压,复苏时间和洗涤条件等多种B.sediminis FA350T的电转化条件。基于捕食性细菌捕食相关基因的研究进展,本文预测了多个捕食相关基因同源基因的结构并进行了突变载体的构建,结果显示B.sediminis FA350T的蛋白结构与已报道的蛋白结构存在差异,大部分突变载体构建成功,但没有筛选到捕食相关基因的缺失突变株。本文通过转座子插入突变的方式筛选到两株捕食作用疑似减弱的突变体。其中一株捕食表型明显减弱的突变体H5-9突变基因和生长情况结果显示多个基因发生突变,突变体生长能力增强,生物膜形成能力减弱,但并未获得转座子插入突变的位点。本文通过实验表明捕食性细菌B.sediminis FA350T改变了海洋沉积物的微生物群落结构,暗示慢生单胞菌等捕食性细菌在海洋微生物群落演化过程同样扮演着重要的角色,对进一步了解慢生单胞菌等捕食性细菌在海洋生态系统中的作用提供了基础。本文构建了慢生单胞菌的遗传操作体系,对后期进一步研究慢生单胞菌的捕食机制及探究慢生单胞菌捕食作用对海洋微生物群落结构的影响提供了技术基础。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：Q938
【部分图文】：

Ｐｒｅｙ??ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ??Ｎｕｔｒｉｅｎｔ?ｉｎｃｒｅａｓｅ?＾?（ｂ）?Ｓｃｏｕｔｉｎｇ??ｉｑＪＴｗ?（ｃ）?Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ?▼??（ｈ）?Ｓｐｏｒｅｓ?Ｗ??Ｐｒｅｙ??ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ??（ｇ）?Ｆｒｕｉｔｉｎｇ?ｆｆ?＾?＾?＾?＼??＾?Ｊ?＼??Ｍ?Ｈｉｇｈ?ｄｅｎｓｉｔｙ，??▲?Ｍ?ｎｏ?ｐｒｅｙ?（ｄ）?Ｐｒｅｄａｔｉｏｎ??Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ?＼??Ｊ??ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ??（ｅ）?Ｒｉｐｐｌｉｎｇ?Ｋ??图１－５黄色粘球菌的捕食性生命周期［７５］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ｔｈｅ?ｐｒｅｄａｔｏｒｙ?ｌｉｆｅ?ｃｙｃｌｅ?ｏｆ?Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ?ｘａｎｔｈｕｓ?［７５］??１．３微宇宙技术??２０世纪９０年代末至２１世纪初，全球环境面临挑战，生物多样性受到威胁??［８５］。预防或减轻环境变化生态影响的政策需要强有力的科学证据，但全球环??境问题的研究需要大量的人力和无力，且耗时较长，无法在短时间内获得有效??的措施［８６］。而由于微宇宙实验规模小，实验重复性高，周期短，且己有证据??表明小规模的实验结果成功应用到更大的规模的生产的基础上等优点，因此早??期的微宇宙主要应用于解决生态问题政策的制定［８７］。微宇宙（ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ）是??一种人工简化的生态系统，用于在受控条件下模拟和预测自然生态系统的行为。??这种人工简化的生态系统，实验对象的选取多种多样，既可以直接基于采集样??品也可以自由挑选组合形成不同的生态系统进行实验。Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ柱是微宇??宙实验技术中直接基于采集样品进行实验的典型代表（图１－６），其主要通过在??实

发会对海洋中的浮游生物造成伤害，Ｗａｎｇ等通过微宇宙实验探宄了原油泄露??导致水华爆发的原因，发现可能是氮源限制了海洋蓝细菌的固氮作用而导致其??大量增殖，氮源的添加能够有效的降低水华的损害［９７］；线虫能够捕食细菌细??胞和真菌菌丝，在土壤养分循环中起重要作用，Ｋｉｔａｇａｍｉ等通过构建松树，真??菌及土壤线虫的微宇宙实验模型，探究了温度，线虫群落，真菌及宿主（松树）??之间的多营养相互作用［９８］；自然条件下直接测量微生物的适应性是一种挑战，??Ｂｌｅｕｖｅｎ等通过微宇宙实验探究了自然微生物群落对不同的■Ｓａｃｃ／ｊａｒｏｍｙｃｅｙ??适应性的影响，暗示微生物之间的相互作用及对物种的适应性及进??化的影响［９９］。??

山东大学硕士学位论文??＃?？?ＳＯＵＭ２２Ｃ００９?ＳＤＵＭ２２８０２？??■?■??”?；，ｔ．ｒ?＊?？？?碰一：??？「?■■??５〇?ｓ?ＥＭＰＯ」ｅｖｅｔ２??Ｎｏｎ－ｓａｌｉｎｅ?（ｎ?＊?８６０）：??＇?Ｓａｌｉｎｅ?（ｎ?＝?５７３）?ｊ??１００！?Ｗ?０１?１００?Ｅ??图１－８慢生单胞菌的生物地理学分布（Ａ）和捕食作用（Ｂ）［１０６］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－８?Ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ?ｄｉｒｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｂｒａｄｙｍｏｎａｄａｌｅｓ?（Ａ）ａｎｄ?ｐｒｅｄａｔｉｏｎ（Ｂ）［１０６］??ｔ??尔盐沼的浅表沉积物［１０７］，生存相关的环境微生物［１０８］，沿海珊??瑚礁［丨０９］和西弗拉姆海峡中［１１０］均被检测到具有较高的丰度。这些研宄中慢??生单胞菌生境的盐度与已分离得到的慢生单胞菌生长条件（１－９％?ＮａＣｌ）基本??一致［１０１］，但Ｃｈｅｎ等在淡水养殖■中同样检测到慢生单胞菌，??这些检测到的慢生单胞菌分类信息尚不可知［１１１］，表明慢生单胞菌可能存在淡??水分支，其分布范围可能更广泛。??Ｓ．此―ｓＦＡ３５０Ｔ表现出具有捕食其他细菌的特性（图１－８Ｂ）。基因组分??析表明５．此ＦＡ３５０７具有ＡＢＣ－转运蛋白，ＩＶ型菌毛，ＩＩ型分泌系统，??毒素和趋化性等相关基因［１１２］。Ｓｈａｒｍａ等对粘细菌ＩＶ型菌毛进化的研究中分??析和Ｓｏｒａｎｇ／ｈｅａｅ两类粘细菌与可能具有共??同的祖先［１１３］，和Ｓｏｒａｔｔｇ／ｈｅａｅ是两类主要的海洋粘细菌，这??两类细菌可能都具有抗细菌的能力［１１４－１１６］，可能有助于解释慢生单胞菌捕食??能力的来源。?
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本文编号：2860937