常温细菌复合菌系降解木质素的协同作用解析

发布时间：2020-11-01 06:11

　　 天然木质素结构复杂难以降解,微生物协同降解木质素机制尚不完全清楚。为明确木质素降解复合菌系在不同时期的微生物群落结构变化规律,探究微生物降解木质素的协同作用关系。我们取复合菌系的种子液和木质素降解初期、高峰期与末期样品,对其样品进行16S rRNA基因高通量测序;取复合菌系木质素降解初期和高峰期样品,对其样品进行宏转录组高通量测序。以期从DNA和RNA层面共同阐释复合菌系的协同降解作用关系,解析微生物菌群在降解木质素过程中的贡献。基于16S rRNA基因注释微生物多样性发现,种子液中的主要优势菌属为Pseudomonas(28.24%)、Ruminofilibacter(26.87%)、Sphaerochaeta(19.47%)、Caenispirillum(7.97%)、Mangroviflexus(2.52%);降解初期的主要优势菌属为Pseudomonas(22.08%)、Thauera(5.38%)、Pannonibacter(6.60%)、Anaerocolumna(6.47%)、Sphaerochaeta(5.57%)、Caenispirillum(5.52%)、Proteiniphilum(4.68%);降解高峰期的主要优势菌属为Anaerocolumna(44.78%)、Pseudomonas(20.93%)、Sphaerochaeta(5.57%)、Caenispirillum(5.52%)、Ruminofilibacter(4.10%)、Paenibacillus(3.81%)、Thauera(3.65%);在降解末期的优势菌属为Ruminofilibacter(22.76%)、Sphaerochaeta(17.29%)、Pseudomonas(12.55%)、Caenispirillum(8.95%)、Mangroviflexus(7.49%)、Azospirillum(6.50%)、Thauera(2.19%)。基于宏转录组学注释微生物多样性发现,复合菌系中的转录本信息主要来源于Clostridium(21.62%-49.35%)、Lachnoclostridium(17.11%-19.40%)、Cellulosilyticum(3.96%-10.84%)、Thermoanaerobacterium(1.08%-7.99%)、Herbinix(3.17%-3.76%)、Bacillus(2.89%-3.34%)、Proteiniphilum(1.00%-3.41%)。基于16S rRNA基因注释方法和宏转录组学方法分析,发现两种检测方式下共同拥有的细菌属有28个,后者检测到的微生物种类更丰富。利用四种常用蛋白功能数据库对复合菌系的功能和代谢特征注释,发现复合菌系中微生物的功能主要集中在碳水化合物代谢和氨基酸代谢,表明了复合菌系含有大量与碳水化合物相关的酶基因以及功能微生物。利用CAZy数据库进一步对复合菌系中的木质纤维素酶基因进行注释分析。发现编码木质素降解酶的有6个AAs家族基因,编码纤维素降解酶的有7个GHs和2个CEs家族基因,编码半纤维素降解酶的有12个GHs和4个CEs家族基因,编码寡糖降解酶的有34个GHs家族基因,以及具有能够结合底物从而起到辅助降解作用的27个CBMs家族基因,共有27种微生物编码这些酶基因,推测出复合菌系主要以解聚木质素本体的酚氧化途径和降解小分子化合物的非酚氧化途径即为芬顿反应以及对半纤维素类杂多糖的水解来实现木质素的高效降解。分析以上结果可知,在降解木质素过程中,不同降解时期复合菌系群落结构、功能和代谢特征变化显著。碳水化合物代谢相关的基因在复合菌系中转录活跃。根据获得的复合菌系降解木质素的功能酶基因以及编码的功能微生物,化抽象为具体,构建出复合菌系对木质素高效降解模型,揭示了复合菌系高效降解木质素的协同作用关系,为细菌复合菌系的木质素高效降解机制提供理论指导和数据支撑。
【学位单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：Q933
【部分图文】：

常温细菌复合菌系降解木质素的协同作用解析2图1-1木质素结构Fig.1-1Structureoflignin虽然木质素的结构已被广泛研究，但由于其复杂和不规则的基质结构导致木质素很难被直接利用。目前世界各地的研究团体已经开发了多种使用化学、机械、物理和生物学方法，从木质纤维素网络中将木质素分离和利用木质素。随着近年来关于木质素增值和预处理方法开发[13,14]，与其他方法相比，生物学方法在经济和环保方面有很大优势，也符合中国当前的可持续发展国情[15]。1.2.2木质素降解微生物的研究进展1.2.2.1木质素降解真菌的研究进展目前研究较多的白腐菌有：黄孢原毛平革菌、射脉菌、变色栓菌、虫拟蜡菌、烟管菌等[16]。其中，黄孢原毛平革菌更是由于突出的木质素降解能力，而成为真菌降解木质素研究的模式菌株[17]。真菌在木质纤维素生物质生产乙醇、农副产品的生物转化和生物漂白等方面得到广泛应用[18,19]。虽然真菌在木质素的分解中比细菌中更有效，但其脱木素化慢且有限[20]。Arimoto等[21]过表达了密粘褶菌KU-4的一种内源酶，使乙醇的产量提高了45%，木质素的降解能力大幅提升。Kneevi等[22]发现氨基苯甲醚能提高毛栓白腐菌对木质素的选择性。在生态系统中，木质素降解真菌大多以腐生菌或弱寄生物的形式存在。然而真菌，尤其是曲霉类真菌具有一定的潜在致病性，其孢子易传播、污染，发酵液具有刺激性气味等弊端。1.2.2.2木质素降解细菌的研究进展细菌这种无处不在的微生物群体广泛分布于全球的自然生态系统中。木质素降解细菌也广泛存在白蚁肠道、牛胃等生境中，如芽孢杆菌属等[23-26]，其主要是通过产生次生代谢物和细胞外酶对木质素进行分解[27,28]。Paliwal等[29]从造纸废水污染的土壤中分离出巨大芽孢杆菌和假单胞菌能够促进造纸黑液中的木质素

结果与分析133结果与分析3.1木质素降解复合菌系的降解特性3.1.1复合菌系在降解水稻秸秆过程中生长量的变化分析从接菌开始计时，在无菌条件下按照试验计划取样。测定此时复合菌系在600nm波长下的吸光度值，从而来检测复合菌系在降解木质素过程中生长量变化情况。如图3-1所示，随着木质素的降解，复合菌系的OD值变化趋势为先迅速升高，经过缓慢升高后到达最高点，随后开始呈现下降趋势。此变化趋势反映出了微生物生长的4个不同时期。复合菌菌系在培养的前12h里，OD值有所增长至0.16。在第1d-2d时间里，OD值迅速增长，从0.23增长至0.67，在此时间段内木质素被快速降解。从第2d之后，OD值缓慢增长直到第5d达到顶峰进入稳定生长期，此时OD值为0.95。从第5d开始之后，OD值开始下降，此后水稻秸秆几乎不再被降解，到第7d培养结束，此时复合菌系的OD值为0.69。根据以上数据结果发现，复合菌系在不同降解时期均有较高的代谢活性，为后续高通量测序所需DNA量和RNA量的充足得到保证。图3-1复合菌系生长量变化情况Fig.3-1Thegrowthchangeofconsortium.3.1.2复合菌系在降解水稻秸秆过程中体系pH的变化分析从接菌开始计时，在无菌条件下按照试验计划取样。测定复合菌系在降解木质素过程中体系的pH变化趋势，如图3-2所示。随着木质素的降解，复合菌系的pH值变化趋势呈现为先迅速下降，之后缓慢回升，最后趋于中性。接种后体系的初始pH为7.73，随着木质素的降解，体系的pH在前2d时快速下降，到第2d下降到最低点，此时pH为6.56。

复合菌系培养体系pH变化情况
【参考文献】

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本文编号：2865133