布鲁氏菌分泌蛋白的筛选及Bsec103蛋白功能的初步研究

发布时间：2020-11-06 07:38

　　 布鲁氏菌病(Brucellosis)是布鲁氏菌(Brucella)引起的人兽共患性疾病,严重威胁人类健康和畜牧业发展。布鲁氏菌作为兼性胞内寄生菌,其分泌系统和分泌蛋白在增殖和扩散过程中都发挥着重要作用。为了进一步确定布鲁氏菌中所包含的主要分泌系统的分布情况,使用MacSyFinder结合TXSSdb、SSPred、T346Hunter数据库中的模型,对B.abortus 2308,B.melitensis 16M,B.suis 1330等不同种型的18株布鲁氏菌基因组进行分析。结果显示18株布鲁氏菌中均具有Ⅳ、Ⅴ型分泌系统,不存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ型分泌系统。除了Brucella melitensis ATCC 23457中不含有T5cSS外,其他菌株中都含有V型分泌系统T5aSS和T5cSS的两种亚型,但是在数量上存在一定的差异。目前文献报道的布鲁氏菌分泌蛋白有28个,其中15个蛋白经Ⅳ型分泌系统分泌。布鲁氏菌的分泌蛋白在其复制增殖以及逃避宿主免疫应答等过程中发挥了重要作用。为了挖掘新的布鲁氏菌分泌蛋白,进一步探索布鲁氏菌的致病机制,本研究使用S4TE 2.0和EffectiveDB程序,对B.abortus 2308株基因组数据进行分析,预测出193个候选分泌蛋白,其中染色体I中138个,染色体II中55个。以B.abortus 2308为模板构建重组pZL1790载体64个,根据TEM-1报告系统判定标准,两个重组载体呈现阳性结果。根据蛋白分子量大小分别命名为Bsec24和Bsec103。EggNOG蛋白功能注释结果显示,Bsec24为酯酶/脂肪酶/硫酯酶,Bsec103为核糖核酸酶E和G。为了进一步研究分泌蛋白Bsec24和Bsec103对布鲁氏菌毒力的影响,研究分别构建了分泌蛋白基因缺失株2308ΔBsec24和2308ΔBsec103。将缺失株和亲本株B.abortus 2308分别感染RAW264.7细胞,监测细胞载菌量的变化。结果显示2308ΔBsec24株感染后细胞载菌量与亲本株无明显差异,2308ΔBsec103株感染48h的细胞载菌量明显低于亲本株。进一步分析感染48小时的B.abortus 2308株感染组和2308ΔBsec103株感染组RAW264.7细胞的转录组数据,结果显示,与细胞内质网应激相关的基因Cryab和Casp12表达量显著升高,提示Bsec103蛋白可能在调控宿主细胞内质网应激过程中发挥了重要作用。
【学位单位】：中国兽医药品监察所
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

R囊泡融合，来促进布鲁氏菌增殖。在Yip1A敲除的细胞中，布鲁氏菌不能形成rBCV，使其保留在溶酶体内。IRE1的敲除导致IRE1α途径不能被激活，呈现相同现象[13]。Yip1A激活UPR的IRE1α通路后，Atg9和WIPI1在ERES募集，并上调ER衍生的细胞质被膜复合体Ⅱ(ThecoatproteincomplexⅡ,COPⅡ)的组分Sar1、Sec23和Sec24D，增强COPⅡ囊泡从ERES分泌的能力。研究表明COPⅡ囊泡是自噬体膜的来源，在自噬体形成过程中起到重要作用[14]。自噬相关蛋白在rBCV向aBCV的转化中起重要作用，而Yip1A在布鲁氏菌的复制和aBCV的形成中也是必需的。图1.1布鲁氏菌的胞内转运模型(自绘)Figure1.1IntracellulartransportmodelofBrucella(byauthor)BCV酸化(pH降低至4.0-4.5)是BCV成熟过程中的一个重要环节，酸性环境有助于布鲁氏菌VirB操纵子的表达[15]，VirB操纵子调控的Ⅳ型分泌系统(typeIVsecretionsystem,T4SS)对其胞内生存是必须的。除了T4SS以外，双组分调节系统(two-componentregulatorysystem,BvrS/BvrR)、环状β-葡聚糖(cyclicβ-glucan)、LuxR样转录调节因子(LuxR-liketranscriptionalregulator,VjbR)、布鲁氏脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、鞭毛样结构(flagellum-likestructure)、类转运蛋白

芓LR4和TLR2信号传导[40]。通过这种方式，布鲁氏菌抑制DC的成熟和促炎细胞因子IL-12和TNF-α等的产生。此外，该蛋白质还抑制了CD8+T细胞对布鲁氏菌靶细胞的杀伤作用[41]。效应蛋白BspB通过与保守的寡聚高尔基体(conservedoligomericGolgi,COG)相互作用，调节COG依赖性运输，将高尔基体衍生的囊泡重定向到BCV，促进rBCV的形成，从而促进布鲁氏菌的胞内增殖[42]。布鲁氏菌二氧四氢喋啶合成酶(BrucellaLumazineSynthase,BLS)通过TLR4传递信号，诱导DC成熟和CD8+T细胞毒性作用，来抑制肿瘤生长，调节先天和适应性免疫应答[43]。图1.2宿主细胞对布鲁氏菌的免疫应答反应[19]Figure1.2ImmuneresponseofhostcellstoBrucella[19]1.3.3布鲁氏菌逃避宿主免疫反应的其他机制1.3.3.1布鲁氏菌抑制细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis)是一种调控细胞程序性死亡的方式，通常由半胱天冬氨酸水解酶(Caspase)启动，促进对胞内寄生菌的防御性反应。抑制感染细胞的凋亡也是布鲁氏菌维持其胞内存活的重要逃逸方式。布鲁氏菌感染后诱导细胞内钙水平上调是其在巨噬细胞内存活的重要因素之一。感染后胞内钙依赖的E3泛素连接酶Nedd4的活性显著增加，通过降解钙依赖性蛋白酶calpain2，抑制巨噬细胞凋亡[44]。此外，锌指蛋白A20会影响肿瘤坏死因子受体1(tumornecrosisfactorreceptor1，TNFR1)的信号通路，同时抑制巨噬细胞活化和凋亡。A20上调导致NF-κB通路的抑

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1 谢士杰;布鲁氏菌分泌蛋白的筛选及Bsec103蛋白功能的初步研究[D];中国兽医药品监察所;2020年

本文编号：2872851