拟南芥卷叶突变体da3-1抑制子（sud）的筛选鉴定和SUD3基因的克隆与功能研究

发布时间：2020-11-18 06:17

　　 提高作物的产量和生物量是实现作物高产的重要途径,也是解决粮食与能源危机的重要手段之一。种子和器官大小是重要的农艺性状,研究种子和器官大小调控机制对解决当前面临的粮食危机具有重要的理论意义和实践价值。目前,对模式植物拟南芥种子和器官大小的调控研究已经取得了一定的进展。DA3基因是拟南芥中控制种子和器官大小的一个很重要的基因,它编码一个泛素相关蛋白,da3-1突变体具有较大的种子和花器官,并且伴随莲座叶卷叶表型。但是DA3基因控制种子和器官大小的机制尚不清楚。为了揭示DA3基因调控种子和器官大小的机制,本文在da3-1突变体背景下利用EMS诱变的遗传筛选方法,筛选和鉴定出了da3-1抑制子87个,这些抑制子在遗传关系上和DA3基因很可能有相互关系。在众多抑制子中,本文选择抑制子sud3 (the suppressor of da3-1 gene)作为研究对象,sud3能够很好地抑制da3-1突变体表型,其种子和莲座叶基本恢复到野生型水平。本研究通过重测序方法获得抑制子备选基因,转基因互补确定后,通过花瓣GFP亚细胞定位,子叶细胞数目分析,子叶细胞倍性分析,核内复制分析,对SUD3基因调控种子和器官大小功能进行了初步探究。发现SUD3基因是DA3-1基因很好的抑制子；该基因亚细胞定位在细胞核内；SUD3基因在植株表型、细胞倍性、细胞扩展和核内复制方面都能很好的抑制DA3-1基因的表达；我们有理由相信SUD3基因是DA3-1基因调控器官和种子大小调控途径中的关键因子；同时SUD3基因并不参与细胞扩展,而是通过抑制细胞增殖,负向调控种子和器官的大小。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q943.2
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 植物发育和器官发生
    1.2 拟南芥作为模式植物的原因和意义
    1.3 拟南芥作为模式植物研究历程
    1.4 拟南芥基因组学研究
        1.4.1 拟南芥功能基因组计划
        1.4.2 拟南芥诱变产生突变体的方法
    1.5 图位克隆
        1.5.1 图位克隆（Map-based cloning）基本原理
        1.5.2 图位克隆基本过程
        1.5.3 图位克隆用到的主要技术
    1.6 拟南芥调控器官大小的基因和功能研究
        1.6.1 器官和种子大小
        1.6.2 母性效应的调控因子调控植物种子和器官大小
        1.6.3 合子相关的调控因子调控植物种子和器官大小
        1.6.4 激素及相关基因调控植物种子和器官大小
        1.6.5 泛素相关途径调控植物种子和器官大小
    1.7 背景基因介绍
        1.7.1 DA3基因
    1.8 研究目标和意义
        1.8.1 研究目标
        1.8.2 研究意义
第2章 材料和方法
    2.1 实验材料和试剂
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂
    2.2 试验方法
        2.2.1 营养土的配制
        2.2.2 移苗注意事项
        2.2.3 种子灭菌
        2.2.4 种子春化
        2.2.5 拟南芥培养条件
        2.2.6 突变体的获得
        2.2.7 温室材料的看护
        2.2.8 杂交操作
        2.2.9 DNA的提取
        2.2.10 MS法蹄选DA3-1突变体抑制子
        2.2.11 T-DNA激活标签法进行突变体筛选
        2.2.12 植物基因组DNA的提取
        2.2.13 植物总RNA的提取
        2.2.14 RNA浓度和纯度检测
        2.2.15 cDNA获得
        2.2.16 质粒的提取
        2.2.17 琼脂糖凝胶DNA的回收
        2.2.18 无缝克隆组装构建载体
        2.2.19 DA3-1基因和SUD3基因背景鉴定
        2.2.20 测序方法获得备选目的基因
第3章 结果与分析
    3.1 EMS诱变da3-1突变体
        3.1.1 da3-1突变体抑制子筛选
        3.1.2 筛选出的抑制子
    3.2 da3-1抑制子sud3
        3.2.1 遗传互补实验
    3.3 SUD3基因结构和蛋白结构
        3.3.1 SUD3基因结构
        3.3.2 SUD3蛋白结构
        3.3.3 SUD3基因进化树
    3.4 SUD3基因表型
    3.5 SUD3基因亚细胞定位
    3.6 SUD3基因器官大小机制探究
        3.6.1 种子大小对比分析
        3.6.2 子叶细胞数目分析
        3.6.3 细胞倍性分析
        3.6.4 剪接变化分析
    3.7 筛选突变体方法研究
        3.7.1 EMS诱变筛选结果
        3.7.2 分离基因的方法探究
        3.7.3 EMS诱变浓度研究
        3.7.4 连锁测试经验
        3.7.5 遗传互补经验
    3.8 引物设计原则
第四章 结论与讨论
    4.1 结论
    4.2 展望
参考文献
致谢

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本文编号：2888409