鸡TGF-β1在H9N2亚型禽流感病毒诱导大肠杆菌继发感染中的作用
发布时间：2021-01-10 07:27
H9N2亚型低致病性禽流感病毒（LPAIV）在世界各地广泛流行,与其他细菌的共感染尤其是与大肠杆菌的混合感染导致养禽业蒙受严重的经济损失。虽然H9N2病毒感染已被证明可促进细菌感染,但其机制尚不清楚。通过实验室前期研究,初步筛选了一些可能与细菌粘附相关的蛋白如TGF-β1、整合蛋白、皮层蛋白、钙粘蛋白、黏着斑蛋白、纤调蛋白等。其中TGF-β1作为一种免疫调节因子和促炎因子能够介导某些细菌粘附。目前关于TGF-β1的大部分研究主要集中在人源,而关于鸡TGF-β1（与人源的氨基酸序列同源性仅约60%）与禽病原菌感染之间相关性的研究尚未有报道。鸡TGF-β1蛋白可能在H9N2病毒诱导的继发性大肠杆菌感染中发挥重要的作用,但是其中更为详细的机制还仍不清楚。因此,本研究以病毒、细菌和宿主之间的关系为基础,揭示参与H9N2 AIV引起的继发性细菌感染的宿主因素,提供一种解释流感病毒和细菌之间的协同致病机制的新的理论依据,有望为抗感染药物的研究提供潜在的分子靶点。本研究分为以下三个部分:1.H9N2 AIV对大肠杆菌粘附宿主的能力及特性分析将鸡胚成纤维细胞（DF-1）在6孔细胞板上培养,长至单层后随...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组pET-28a(+)-TGF-β1质粒双酶切鉴定图
鸡TGF-β1在H9N2禽流感病毒诱导感染大肠杆菌中的作用24ABC图2重组蛋白TGF-β1的SDS-PAGE(A、B)、和Westernblot分析(C)Fig.2SDS-PAGEandWesternblotoftheTGF-β1注：（A）不同诱导时间下的SDS-PAGE鉴定图。M：蛋白Marker；1:阴性对照4-5依次为诱导表达2h、4h、6h、8h时的产物；（B）纯化后SDS-PAGE鉴定图。其中M：蛋白Marker；1：柱层析流出液；2：经纯化的表达产物。（C）Westernblot鉴定图。右图为WB鉴定图。其中M：蛋白Marker；1：诱导表达产物；2：阴性对照。Note:thedrawingistheSDS-PAGEidentificationmapunderdifferentinductiontime.M:Proteinmarker;1:negativecontrol4-5wastheproductofinducedexpressionfor2h,4h,6hand8hinturn;themiddlepicturewastheSDS-PAGEidentificationpictureafterpurification.Amongthem,M:proteinmarker;1:columnchromatographyeffluent;2:purifiedexpressionproduct.(C)Westernblotidentificationmap.M:Proteinmarker;1:inducedexpressionproduct;2:negativecontrol.3.2H9N2AIV对宿主细胞黏附大肠杆菌能力的影响3.2.1H9N2AIV可以增强DF-1细胞对大肠杆菌的粘附能力向长满单层的DF-1细胞接种100MOI（PFU/cell）的H9N2AIV，感染24h进行细胞间接免疫荧光；同时向细胞孔接种100MOI（CFU/cell）的大肠杆菌，将细胞板离心后4℃孵育1.5h，收集细胞，用涂布法对大肠杆菌进行计数。结果显示，可以在DF-1细胞中检测到H9N2病毒（图3A和3B）；与未感染H9N2组相比，DF-1细胞感染H9N2后粘附的大肠杆菌数显著升高（图3C，P<0.05）。
山东农业大学硕士学位论文25图3H9N2AIV感染前后细胞间接免疫荧光（B）和（A）以及DF-1细胞对大肠杆菌的粘附能力变化（C）Fig.3Indirectimmunofluorescence(B)and(A)beforeandafterH9N2AIVinfectionandthechangeofadhesionabilityofE.colitoDF-1cells(C)3.2.2H9N2AIV可以增强SPF鸡体对大肠杆菌的粘附能力将1周龄的SPF鸡鼻腔接种106.375TCID50的H9N2病毒，接种第3天向鸡鼻腔接种106CFU的APEC菌液1.0mL，H9N2病毒感染7d后然后取鸡的气管、肺脏，使用多聚甲醛固定，制作病理组织切片并进行HE染色。同时，用组织切片间接免疫荧光检测H9N2病毒是否在SPF鸡肺中定位。检测鸡肺中大肠杆菌的载量，用涂布法进行计数。病理组织切片结果表明，H9N2感染后气管没有发生明显的病理变化（图4A和4B），可以观察到少量肺泡结构塌陷和炎性细胞聚集（图4C和4D）；免疫荧光结果表明，可以在SPF鸡肺组织中检测到H9N2病毒（图4E和4F）；大肠杆菌粘附结果显示，SPF鸡感染H9N2病毒后，鸡肺内大肠杆菌的相对粘附数量显著上升（图4G）。ABC
本文编号：2968317
【文章来源】：山东农业大学山东省
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组pET-28a(+)-TGF-β1质粒双酶切鉴定图
鸡TGF-β1在H9N2禽流感病毒诱导感染大肠杆菌中的作用24ABC图2重组蛋白TGF-β1的SDS-PAGE(A、B)、和Westernblot分析(C)Fig.2SDS-PAGEandWesternblotoftheTGF-β1注：（A）不同诱导时间下的SDS-PAGE鉴定图。M：蛋白Marker；1:阴性对照4-5依次为诱导表达2h、4h、6h、8h时的产物；（B）纯化后SDS-PAGE鉴定图。其中M：蛋白Marker；1：柱层析流出液；2：经纯化的表达产物。（C）Westernblot鉴定图。右图为WB鉴定图。其中M：蛋白Marker；1：诱导表达产物；2：阴性对照。Note:thedrawingistheSDS-PAGEidentificationmapunderdifferentinductiontime.M:Proteinmarker;1:negativecontrol4-5wastheproductofinducedexpressionfor2h,4h,6hand8hinturn;themiddlepicturewastheSDS-PAGEidentificationpictureafterpurification.Amongthem,M:proteinmarker;1:columnchromatographyeffluent;2:purifiedexpressionproduct.(C)Westernblotidentificationmap.M:Proteinmarker;1:inducedexpressionproduct;2:negativecontrol.3.2H9N2AIV对宿主细胞黏附大肠杆菌能力的影响3.2.1H9N2AIV可以增强DF-1细胞对大肠杆菌的粘附能力向长满单层的DF-1细胞接种100MOI（PFU/cell）的H9N2AIV，感染24h进行细胞间接免疫荧光；同时向细胞孔接种100MOI（CFU/cell）的大肠杆菌，将细胞板离心后4℃孵育1.5h，收集细胞，用涂布法对大肠杆菌进行计数。结果显示，可以在DF-1细胞中检测到H9N2病毒（图3A和3B）；与未感染H9N2组相比，DF-1细胞感染H9N2后粘附的大肠杆菌数显著升高（图3C，P<0.05）。
山东农业大学硕士学位论文25图3H9N2AIV感染前后细胞间接免疫荧光（B）和（A）以及DF-1细胞对大肠杆菌的粘附能力变化（C）Fig.3Indirectimmunofluorescence(B)and(A)beforeandafterH9N2AIVinfectionandthechangeofadhesionabilityofE.colitoDF-1cells(C)3.2.2H9N2AIV可以增强SPF鸡体对大肠杆菌的粘附能力将1周龄的SPF鸡鼻腔接种106.375TCID50的H9N2病毒，接种第3天向鸡鼻腔接种106CFU的APEC菌液1.0mL，H9N2病毒感染7d后然后取鸡的气管、肺脏，使用多聚甲醛固定，制作病理组织切片并进行HE染色。同时，用组织切片间接免疫荧光检测H9N2病毒是否在SPF鸡肺中定位。检测鸡肺中大肠杆菌的载量，用涂布法进行计数。病理组织切片结果表明，H9N2感染后气管没有发生明显的病理变化（图4A和4B），可以观察到少量肺泡结构塌陷和炎性细胞聚集（图4C和4D）；免疫荧光结果表明，可以在SPF鸡肺组织中检测到H9N2病毒（图4E和4F）；大肠杆菌粘附结果显示，SPF鸡感染H9N2病毒后，鸡肺内大肠杆菌的相对粘附数量显著上升（图4G）。ABC
本文编号：2968317
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