重组人EGF、bFGF的高效可溶性表达研究及活性检测
发布时间：2021-01-17 09:46
表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF）都属于细胞生长因子家族中的成员,有广泛的生物学效应。本研究针对人源EGF和bFGF基因序列设计了多个突变体,如:将EGF序列中第4位丝氨酸替换为苏氨酸;在EGF序列中添加亮氨酸和苏氨酸;将bFGF序列中第25位丝氨酸替换为半胱氨酸等。将合成的EGF和bFGF基因序列连接至融合了PLB1结构域或DsbA伴侣标签的pET-28a和pET-42a表达载体中构建重组质粒,将测序结果比对正确的重组质粒转化入E.coli BL21（DE3）感受态细胞中进行表达。实验过程中,在摇瓶小试阶段首先筛选出优势单克隆菌株,并进行建库保存,发酵罐放大培养时考察不同的培养基和培养条件对工程菌发酵密度值的影响,优化EGF和bFGF融合蛋白的表达条件,其次对比不同的破壁缓冲液和洗脱缓冲液对菌体蛋白在层析柱中的分离特性和样品组间分离度的影响,交替使用镍离子亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白。最后采用MTT比色法检测EGF和bFGF蛋白原液的生物学活...
【文章来源】：河北科技大学河北省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
亲和层析
ionBuffer洗脱后，将柱塞泵管头插入到层析柜中的超纯水试剂瓶中，冲洗使各基线水平后，将柱塞泵管头插入到层析柜中的NI-StripBuffer试剂瓶中，对层析柱做脱镍处理，直至层析柱颜色有浅蓝变为白色；⑧用超纯水冲洗亲和层析柱直至各基线水平，接着降低流速用1MNaOH清洗并短时间停留将柱塞泵管头插入到层析柜中的NI-ChargeBuffer试剂瓶中重新挂镍，最后用NI-StorageBuffer填满层析柱放于层析柱储存箱中保存。⑶目的蛋白进一步提纯-离子交换层析离子交换层析（IEX）基于特定pH下的净电荷差异从而达到分离生物分子的目的，如图2-2所示，蛋白电荷取决于可电离氨基酸侧链基团的数量和类型。不同蛋白具有不通的等电点，缓冲液pH低于蛋白等电点时，蛋白带正电并将结合阳离子交换树脂的带负电荷的官能团，高于蛋白等电点时，蛋白是带负电并将结合阴离子交换树脂的带正电荷的官能团。在保证蛋白稳定的前提下下，即可选择阳离子交换层析，又可选择阴离子交换层析。操作方法①将纯化实验所需的玻璃容器、耗材等提前一天置于1MNaOH溶液中浸泡，次日配置实验所需的各缓冲液于磁力搅拌器上充分混匀，调至所需pH值后，使用真空泵抽滤（0.45μm）除菌，将配好的试剂密封保存，放置层析柜中降温至4℃，等图2-2离子交换层析
第3章重组表皮细胞生长因子的制备及检测27第3章重组表皮细胞生长因子的制备及检测3.1构建mPLB1-EGF工程菌3.1.1目的基因的表达设计从GenBank数据库获取EGF基因序列的相关信息，在保证其基本生物学功能的前提下，在天然EGF基因序列中添加1个亮氨酸、1个异亮氨酸和1个天冬氨酸，并将第4位丝氨酸替换为苏氨酸，在C端引入6HisTag，两端引入XhoI和NcoI酶切位点，将设计好的重组EGF序列委托公司合成，并做大肠杆菌密码子偏好性优化，将合成的含EGF目的基因序列的质粒用限制性内切酶XhoI和NcoI双酶切，连接到融合了大消化链球菌proteinL的B1结构域的pET-28a载体中，促使下游目的蛋白高效表达和诱导自折叠，如图3-1所示，重组EGF质粒构建完成后进行相应的检测实验。3.1.2目的基因的重组与转化⑴质粒提取提取pET-28a载体质粒和EGF目的基因质粒，将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，如图3-2所示，由电泳图可看出条带明亮，证明质粒提取成功，用限制性内切酶XhoI和NcoI双酶切EGF目的基因质粒和pET-28a载体质粒，按照限制性内切酶说明书配比酶切体系。按照水，Buffer，质粒DNA，酶的先后顺序加入到PCR管中。M：DNA分子量标准品1：pET-28a载体质粒；2~6：EGF目的基因质粒图3-2目的基因和载体质粒电泳分析图3-1重组EGF质粒构建
【参考文献】：
期刊论文
[1]碱性成纤维细胞生长因子及胰岛素样生长因子1对精原干细胞增殖凋亡影响的机制[J]. 李宏,吴绍华,邱明星,邓青富,雷国林,李青龙. 中国组织工程研究. 2020(19)
[2]碱性成纤维细胞生长因子对压疮愈合的影响[J]. 费益,胡哲清,应锡玫,杨百芬,童松林. 浙江创伤外科. 2019(05)
[3]重组大肠杆菌产人成纤维细胞生长因子8a工业化发酵工艺优化[J]. 王莉洁,孙丹,罗春艳. 生物化工. 2019(05)
[4]bFGF：碱性成纤维细胞生长因子的研究现状与应用[J]. 王远锏. 科技创新与应用. 2019(26)
[5]成纤维细胞生长因子5研究进展[J]. 雷蕾,包鹏甲,梁春年,褚敏,阎萍. 生物技术通报. 2019(03)
[6]成纤维细胞生长因子及其在代谢性疾病中的作用与临床应用研究进展[J]. 刘姗姗,林玮,周剑辉,廖志勇,李校堃,黄志锋. 药学进展. 2019(01)
[7]芦荟凝胶对深Ⅱ度烫伤大鼠创面愈合及EGF、bFGF表达的影响[J]. 刘川玉,唐建红,何洁,肖胜军,蔡蒋帆. 中成药. 2019(01)
[8]EGF基因在动物卵泡发育过程中的研究进展[J]. 许发琼,胡玉琼,郑恒博,吴旭,连森阳,李昂. 黑龙江畜牧兽医. 2018(21)
[9]王不留行黄酮苷激活bFGFR及下游通路促进创伤愈合机制研究[J]. 侯豹,谭方根,史学林,蔡维维,邱丽颖. 药物评价研究. 2018(06)
[10]一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法[J]. 黄学娟,张金迪,张壮,李裕静,曹雪松,胡全安. 基因组学与应用生物学. 2017(12)
博士论文
[1]HB-EGF在支气管哮喘平滑肌重塑中的作用及相关机制研究[D]. 沈毅弘.浙江大学 2014
[2]EGF通过上调TRPM7促进肿瘤细胞迁移的作用和机制研究[D]. 杲海霞.河北医科大学 2012
[3]表皮生长因子受体介导的靶向性基因治疗导入系统[D]. 李宗海.复旦大学 2005
硕士论文
[1]大肠杆菌产有机磷水解酶的发酵工艺研究[D]. 周凯琪.浙江大学 2019
[2]人源白蛋白标准物质的纯化制备及其定值研究[D]. 孔金隆.天津理工大学 2018
[3]重组大肠杆菌表达包涵体药物蛋白的复性与纯化研究[D]. 何伟.华东理工大学 2017
[4]人表皮细胞生长因子在大肠杆菌中的高效表达及功能鉴定[D]. 吴少敏.华南理工大学 2016
[5]十种常见栽培食用菌菌种保藏及菌种扩大工艺优化[D]. 孙磊.鲁东大学 2016
[6]EGF在糖尿病足溃疡创面愈合过程中的作用及机制[D]. 刘如俊.大连医科大学 2014
[7]无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及生物活性的研究[D]. 郭云萍.第四军医大学 2013
[8]利用原核系统表达富含二硫键蛋白质的探索与改进[D]. 刘开泉.山东农业大学 2011
本文编号：2982635
【文章来源】：河北科技大学河北省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
亲和层析
ionBuffer洗脱后，将柱塞泵管头插入到层析柜中的超纯水试剂瓶中，冲洗使各基线水平后，将柱塞泵管头插入到层析柜中的NI-StripBuffer试剂瓶中，对层析柱做脱镍处理，直至层析柱颜色有浅蓝变为白色；⑧用超纯水冲洗亲和层析柱直至各基线水平，接着降低流速用1MNaOH清洗并短时间停留将柱塞泵管头插入到层析柜中的NI-ChargeBuffer试剂瓶中重新挂镍，最后用NI-StorageBuffer填满层析柱放于层析柱储存箱中保存。⑶目的蛋白进一步提纯-离子交换层析离子交换层析（IEX）基于特定pH下的净电荷差异从而达到分离生物分子的目的，如图2-2所示，蛋白电荷取决于可电离氨基酸侧链基团的数量和类型。不同蛋白具有不通的等电点，缓冲液pH低于蛋白等电点时，蛋白带正电并将结合阳离子交换树脂的带负电荷的官能团，高于蛋白等电点时，蛋白是带负电并将结合阴离子交换树脂的带正电荷的官能团。在保证蛋白稳定的前提下下，即可选择阳离子交换层析，又可选择阴离子交换层析。操作方法①将纯化实验所需的玻璃容器、耗材等提前一天置于1MNaOH溶液中浸泡，次日配置实验所需的各缓冲液于磁力搅拌器上充分混匀，调至所需pH值后，使用真空泵抽滤（0.45μm）除菌，将配好的试剂密封保存，放置层析柜中降温至4℃，等图2-2离子交换层析
第3章重组表皮细胞生长因子的制备及检测27第3章重组表皮细胞生长因子的制备及检测3.1构建mPLB1-EGF工程菌3.1.1目的基因的表达设计从GenBank数据库获取EGF基因序列的相关信息，在保证其基本生物学功能的前提下，在天然EGF基因序列中添加1个亮氨酸、1个异亮氨酸和1个天冬氨酸，并将第4位丝氨酸替换为苏氨酸，在C端引入6HisTag，两端引入XhoI和NcoI酶切位点，将设计好的重组EGF序列委托公司合成，并做大肠杆菌密码子偏好性优化，将合成的含EGF目的基因序列的质粒用限制性内切酶XhoI和NcoI双酶切，连接到融合了大消化链球菌proteinL的B1结构域的pET-28a载体中，促使下游目的蛋白高效表达和诱导自折叠，如图3-1所示，重组EGF质粒构建完成后进行相应的检测实验。3.1.2目的基因的重组与转化⑴质粒提取提取pET-28a载体质粒和EGF目的基因质粒，将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，如图3-2所示，由电泳图可看出条带明亮，证明质粒提取成功，用限制性内切酶XhoI和NcoI双酶切EGF目的基因质粒和pET-28a载体质粒，按照限制性内切酶说明书配比酶切体系。按照水，Buffer，质粒DNA，酶的先后顺序加入到PCR管中。M：DNA分子量标准品1：pET-28a载体质粒；2~6：EGF目的基因质粒图3-2目的基因和载体质粒电泳分析图3-1重组EGF质粒构建
【参考文献】：
期刊论文
[1]碱性成纤维细胞生长因子及胰岛素样生长因子1对精原干细胞增殖凋亡影响的机制[J]. 李宏,吴绍华,邱明星,邓青富,雷国林,李青龙. 中国组织工程研究. 2020(19)
[2]碱性成纤维细胞生长因子对压疮愈合的影响[J]. 费益,胡哲清,应锡玫,杨百芬,童松林. 浙江创伤外科. 2019(05)
[3]重组大肠杆菌产人成纤维细胞生长因子8a工业化发酵工艺优化[J]. 王莉洁,孙丹,罗春艳. 生物化工. 2019(05)
[4]bFGF：碱性成纤维细胞生长因子的研究现状与应用[J]. 王远锏. 科技创新与应用. 2019(26)
[5]成纤维细胞生长因子5研究进展[J]. 雷蕾,包鹏甲,梁春年,褚敏,阎萍. 生物技术通报. 2019(03)
[6]成纤维细胞生长因子及其在代谢性疾病中的作用与临床应用研究进展[J]. 刘姗姗,林玮,周剑辉,廖志勇,李校堃,黄志锋. 药学进展. 2019(01)
[7]芦荟凝胶对深Ⅱ度烫伤大鼠创面愈合及EGF、bFGF表达的影响[J]. 刘川玉,唐建红,何洁,肖胜军,蔡蒋帆. 中成药. 2019(01)
[8]EGF基因在动物卵泡发育过程中的研究进展[J]. 许发琼,胡玉琼,郑恒博,吴旭,连森阳,李昂. 黑龙江畜牧兽医. 2018(21)
[9]王不留行黄酮苷激活bFGFR及下游通路促进创伤愈合机制研究[J]. 侯豹,谭方根,史学林,蔡维维,邱丽颖. 药物评价研究. 2018(06)
[10]一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法[J]. 黄学娟,张金迪,张壮,李裕静,曹雪松,胡全安. 基因组学与应用生物学. 2017(12)
博士论文
[1]HB-EGF在支气管哮喘平滑肌重塑中的作用及相关机制研究[D]. 沈毅弘.浙江大学 2014
[2]EGF通过上调TRPM7促进肿瘤细胞迁移的作用和机制研究[D]. 杲海霞.河北医科大学 2012
[3]表皮生长因子受体介导的靶向性基因治疗导入系统[D]. 李宗海.复旦大学 2005
硕士论文
[1]大肠杆菌产有机磷水解酶的发酵工艺研究[D]. 周凯琪.浙江大学 2019
[2]人源白蛋白标准物质的纯化制备及其定值研究[D]. 孔金隆.天津理工大学 2018
[3]重组大肠杆菌表达包涵体药物蛋白的复性与纯化研究[D]. 何伟.华东理工大学 2017
[4]人表皮细胞生长因子在大肠杆菌中的高效表达及功能鉴定[D]. 吴少敏.华南理工大学 2016
[5]十种常见栽培食用菌菌种保藏及菌种扩大工艺优化[D]. 孙磊.鲁东大学 2016
[6]EGF在糖尿病足溃疡创面愈合过程中的作用及机制[D]. 刘如俊.大连医科大学 2014
[7]无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及生物活性的研究[D]. 郭云萍.第四军医大学 2013
[8]利用原核系统表达富含二硫键蛋白质的探索与改进[D]. 刘开泉.山东农业大学 2011
本文编号：2982635
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