柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4互作蛋白的筛选验证及特性分析
发布时间：2021-02-01 11:45
鸡球虫属于顶复器原虫,钙依赖蛋白激酶（CDPKs）是顶复器原虫Ca2+信号通路中的重要效应分子,控制虫体的滑移运动、入侵细胞、虫体发育等重要的生理过程,CDPKs仅存在于植物、绿藻、纤毛虫及顶复器原虫中。由于宿主没有CDPKs,对球虫CDPKs的功能以及在Ca2+信号通路中的作用进行研究,将为开发新型抗球虫药物和研制球虫疫苗提供重要的分子依据。本研究在实验室前期工作的基础上,筛选柔嫩艾美耳球虫CDPK4（EtCDPK4）的潜在互作蛋白,对潜在互作蛋白的特性进行初步分析和相互作用进行验证。1.Co-IP、His pull down与质谱技术筛选Et CDPK4互作蛋白收集与纯化柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊（SO）,提取全蛋白,用Co-IP、His pull down与质谱技术筛选获得4个与EtCDPK4潜在互作的蛋白,分别为延伸因子1α（EtEF1α）、真核翻译起始因子5A（EteIF-5A）、吡咯啉-5-羧酸还原酶（EtPYCR）和14-3-3蛋白（Et14-3-3）。2.四个潜在互作蛋白基因的克隆、原核表达及生物信息学分析以柔嫩艾美耳球虫孢子化...
【文章来源】：上海师范大学上海市
【文章页数】：111 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
纯化的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊
上海师范大学第2章Co-IP、Hispulldown与质谱技术筛选EtCDPK4互作蛋白192.3.2柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊全蛋白的提取用RIPA蛋白裂解液裂解提取孢子化卵囊全蛋白，具体参照说明书进行；首先在1.5mL离心管中加入孢子化卵囊和RIPA裂解液，再加入1/2体积的玻璃珠，充分震荡破碎卵囊壁，显微镜下观察无完整卵囊后离心，收集上清，即为孢子化卵囊全蛋白。采用SDS-PAGE法对提取的蛋白质量进行检测，取20μL上清液，加入5μL的5×SDS上样缓冲液，沸水浴5min，进行凝胶电泳；结束后染色、脱色至出现清晰的条带，用Bio-Rad凝胶成像系统拍照（图2-2）。结果显示，所提取到的全蛋白条带分明，分布均匀，没有降解。图2-2孢子化卵囊全蛋白M:蛋白分子质量标准;1:孢子化卵囊全蛋白Fig.2-2SporulatedoocystsproteinsM:ProteinmolecularweightMarker;1:Sporulatedoocystsproteins2.3.3rEtCDPK4蛋白的纯化及兔抗rEtCDPK4抗血清IgG的收集筛选实验中用到的rEtCDPK4的重组蛋白已经在实验室前期成功连接到pcoldI载体上并成功表达[90]，摸索到的表达条件为：加入1‰的IPTG，16℃诱导24h，诱导后使用His树脂纯化蛋白，SDS-PAGE分析结果表明表达的rEtCDPK4大小为66kDa（图2-3A）。筛选实验中另外用到的兔抗rEtCDPK4多克隆抗体也已经由实验室前期成功制备并储存，我们使用ProteinA+G树脂纯化抗体，获得兔抗rEtCDPK4的IgG；对收集到的IgG进行SDS-PAGE检测。结果显示，收集到的IgG在25kDa和55kDa有两条带（图2-3B），即IgG的轻链和重链，证明其质量良好，可以用于后续实验。
第2章Co-IP、Hispulldown与质谱技术筛选EtCDPK4互作蛋白上海师范大学20图2-3rEtCDPK4蛋白表达(A)及兔抗rEtCDPK4多抗IgG的纯化(B)M:蛋白分子量标准;1:rEtCDPK4上清;2:rEtCDPK4沉淀;3:兔抗rEtCDPK4IgG(pH1.9)Fig.2-3Proteinexpression(A)andpurifiedIgGofrEtCDPK4(B)M:Proteinmolecularweightmarker;1:ThesupernatantofrEtCDPK4;2:TheprecipitatedofrEtCDPK4;3:Rabbitanti-rEtCDPK4IgG(pH1.9)2.3.4免疫共沉淀和Hispulldown银染结果免疫共沉淀使用ThermoFisher提供的PierceCo-ImmunoprecipitationKit，具体步骤按照说明书进行操作：将从兔抗rEtCDPK4多克隆抗体中纯化的IgG首先结合在树脂上，然后加入rEtCDPK4作为诱饵蛋白和提取到的孢子化卵囊全蛋白作为猎物蛋白，在树脂上进行特异性结合，收集洗脱液。Hispulldown实验按照ThermoFisher提供的PierceHisProteinInteractionPull-DownKit说明书进行，即将rEtCDPK4作为诱饵蛋白，孢子化卵囊全蛋白作为猎物蛋白，分别在树脂上孵育，最后收集洗脱液。将两种方法收集到的洗脱液进行SDS-PAGE检测，蛋白胶上样按照pulldown样本组（pull-down-S）、pulldown阴性对照组（pull-down-N）、Co-IP样本组（Co-IP-S）、Co-IP阴性对照组（Co-IP-N）的顺序进行，然后对蛋白胶进行银染分析（图2-4）后送公司进行质谱分析。2.3.5质谱分析结果将两种方法收集到的样本进行shotgun质谱鉴定，与UniProt数据库进行蛋白比对，筛选出来的结果见图2-5和表2-2。结果表明，Hispulldown样本组筛选出70个潜在蛋白、Hispulldown阴性对照组筛选出136个潜在蛋白、Co-IP样本组筛选出413个潜在蛋白、Co-IP阴性对照组筛选出370个潜在蛋白。我们对筛选的结果进行分析处理，发现两者中样本组只筛选出了一种蛋白（图2-5红框），
【参考文献】：
期刊论文
[1]GST pull-down联合LC-MS/MS筛选柑橘抗溃疡病转录因子CsBZIP40的互作蛋白[J]. 窦万福,祁静静,胡安华,陈善春,彭爱红,许兰珍,雷天刚,姚利晓,何永睿,李强. 中国农业科学. 2019(13)
[2]蛋白质互作技术研究进展[J]. 卢艳艳,王超,侍福梅. 湖北农业科学. 2019(12)
[3]His-pull down联合质谱鉴定谷氨酸棒杆菌中乙酰羟酸合酶IlvN的相互作用蛋白[J]. 侯正杰,张权威,莫晓琳,夏利,谭淼,孙全伟,马倩,陈宁. 食品与发酵工业. 2019(16)
[4]P5CR基因的进化及其在木薯中的表达分析[J]. 丁泽红,付莉莉,颜彦,铁韦韦,胡伟. 生物技术通报. 2018(03)
[5]植物中钙依赖蛋白激酶（CDPK）的研究进展[J]. 武志刚,武舒佳,王迎春,郑琳琳. 草业学报. 2018(01)
[6]免疫共沉淀联合质谱技术筛选宿主因子CypB的互作蛋白[J]. 张頔,赵魁,周艳龙,赵宇航,钟嘉伟,崔珊珊,高丰,宋德光. 中国兽医学报. 2017(05)
[7]3种探究蛋白质互作实验技术简介[J]. 姚亭秀. 生物学通报. 2016(05)
[8]小麦中小GTP结合蛋白基因TaRop2克隆及其表达分析[J]. 李媛媛,安艳秋,王凤涛,冯晶,蔺瑞明,陈万权,徐世昌. 植物遗传资源学报. 2015(02)
[9]弓形虫CDPK1-EF基因的克隆与原核表达[J]. 刘思嘉,徐前明,李培英. 畜牧与兽医. 2014(02)
[10]双分子荧光互补技术的应用与展望[J]. 史彦薇,孔建强,安建梅. 药物生物技术. 2013(05)
博士论文
[1]与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定[D]. 王一凡.华中农业大学 2015
[2]华北大黑鳃金龟嗅觉相关蛋白互作机制研究[D]. 王冰.中国农业科学院 2013
[3]一种新的hTERT相互作用蛋白的筛选及鉴定[D]. 周丽娜.第三军医大学 2013
硕士论文
[1]Ig样结构域对嗜热酯酶Tn0664的影响[D]. 郝薇薇.吉林大学 2017
[2]柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建及钙依赖蛋白激酶3相互作用蛋白的筛选[D]. 徐帅兵.中国农业科学院 2017
[3]柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4功能特性的初步研究[D]. 王自文.中国农业科学院 2016
[4]二穗短柄草BdCDPK4和BdCDPK14基因的克隆、表达分析及遗传转化研究[D]. 赵旭东.华中科技大学 2015
[5]柔嫩艾美耳球虫微线蛋白与宿主表皮生长因子受体相互作用的研究[D]. 杨拓.吉林大学 2014
[6]基于荧光蛋白的蛋白酶和蛋白激酶检测新方法[D]. 王茗.湖南大学 2013
[7]柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶的研究[D]. 李洋.中国农业科学院 2010
[8]CDPK4亚细胞定位、超表达和RNAi载体构建与辣椒转化[D]. 朱万里.福建农林大学 2010
本文编号：3012718
【文章来源】：上海师范大学上海市
【文章页数】：111 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
纯化的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊
上海师范大学第2章Co-IP、Hispulldown与质谱技术筛选EtCDPK4互作蛋白192.3.2柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊全蛋白的提取用RIPA蛋白裂解液裂解提取孢子化卵囊全蛋白，具体参照说明书进行；首先在1.5mL离心管中加入孢子化卵囊和RIPA裂解液，再加入1/2体积的玻璃珠，充分震荡破碎卵囊壁，显微镜下观察无完整卵囊后离心，收集上清，即为孢子化卵囊全蛋白。采用SDS-PAGE法对提取的蛋白质量进行检测，取20μL上清液，加入5μL的5×SDS上样缓冲液，沸水浴5min，进行凝胶电泳；结束后染色、脱色至出现清晰的条带，用Bio-Rad凝胶成像系统拍照（图2-2）。结果显示，所提取到的全蛋白条带分明，分布均匀，没有降解。图2-2孢子化卵囊全蛋白M:蛋白分子质量标准;1:孢子化卵囊全蛋白Fig.2-2SporulatedoocystsproteinsM:ProteinmolecularweightMarker;1:Sporulatedoocystsproteins2.3.3rEtCDPK4蛋白的纯化及兔抗rEtCDPK4抗血清IgG的收集筛选实验中用到的rEtCDPK4的重组蛋白已经在实验室前期成功连接到pcoldI载体上并成功表达[90]，摸索到的表达条件为：加入1‰的IPTG，16℃诱导24h，诱导后使用His树脂纯化蛋白，SDS-PAGE分析结果表明表达的rEtCDPK4大小为66kDa（图2-3A）。筛选实验中另外用到的兔抗rEtCDPK4多克隆抗体也已经由实验室前期成功制备并储存，我们使用ProteinA+G树脂纯化抗体，获得兔抗rEtCDPK4的IgG；对收集到的IgG进行SDS-PAGE检测。结果显示，收集到的IgG在25kDa和55kDa有两条带（图2-3B），即IgG的轻链和重链，证明其质量良好，可以用于后续实验。
第2章Co-IP、Hispulldown与质谱技术筛选EtCDPK4互作蛋白上海师范大学20图2-3rEtCDPK4蛋白表达(A)及兔抗rEtCDPK4多抗IgG的纯化(B)M:蛋白分子量标准;1:rEtCDPK4上清;2:rEtCDPK4沉淀;3:兔抗rEtCDPK4IgG(pH1.9)Fig.2-3Proteinexpression(A)andpurifiedIgGofrEtCDPK4(B)M:Proteinmolecularweightmarker;1:ThesupernatantofrEtCDPK4;2:TheprecipitatedofrEtCDPK4;3:Rabbitanti-rEtCDPK4IgG(pH1.9)2.3.4免疫共沉淀和Hispulldown银染结果免疫共沉淀使用ThermoFisher提供的PierceCo-ImmunoprecipitationKit，具体步骤按照说明书进行操作：将从兔抗rEtCDPK4多克隆抗体中纯化的IgG首先结合在树脂上，然后加入rEtCDPK4作为诱饵蛋白和提取到的孢子化卵囊全蛋白作为猎物蛋白，在树脂上进行特异性结合，收集洗脱液。Hispulldown实验按照ThermoFisher提供的PierceHisProteinInteractionPull-DownKit说明书进行，即将rEtCDPK4作为诱饵蛋白，孢子化卵囊全蛋白作为猎物蛋白，分别在树脂上孵育，最后收集洗脱液。将两种方法收集到的洗脱液进行SDS-PAGE检测，蛋白胶上样按照pulldown样本组（pull-down-S）、pulldown阴性对照组（pull-down-N）、Co-IP样本组（Co-IP-S）、Co-IP阴性对照组（Co-IP-N）的顺序进行，然后对蛋白胶进行银染分析（图2-4）后送公司进行质谱分析。2.3.5质谱分析结果将两种方法收集到的样本进行shotgun质谱鉴定，与UniProt数据库进行蛋白比对，筛选出来的结果见图2-5和表2-2。结果表明，Hispulldown样本组筛选出70个潜在蛋白、Hispulldown阴性对照组筛选出136个潜在蛋白、Co-IP样本组筛选出413个潜在蛋白、Co-IP阴性对照组筛选出370个潜在蛋白。我们对筛选的结果进行分析处理，发现两者中样本组只筛选出了一种蛋白（图2-5红框），
【参考文献】：
期刊论文
[1]GST pull-down联合LC-MS/MS筛选柑橘抗溃疡病转录因子CsBZIP40的互作蛋白[J]. 窦万福,祁静静,胡安华,陈善春,彭爱红,许兰珍,雷天刚,姚利晓,何永睿,李强. 中国农业科学. 2019(13)
[2]蛋白质互作技术研究进展[J]. 卢艳艳,王超,侍福梅. 湖北农业科学. 2019(12)
[3]His-pull down联合质谱鉴定谷氨酸棒杆菌中乙酰羟酸合酶IlvN的相互作用蛋白[J]. 侯正杰,张权威,莫晓琳,夏利,谭淼,孙全伟,马倩,陈宁. 食品与发酵工业. 2019(16)
[4]P5CR基因的进化及其在木薯中的表达分析[J]. 丁泽红,付莉莉,颜彦,铁韦韦,胡伟. 生物技术通报. 2018(03)
[5]植物中钙依赖蛋白激酶（CDPK）的研究进展[J]. 武志刚,武舒佳,王迎春,郑琳琳. 草业学报. 2018(01)
[6]免疫共沉淀联合质谱技术筛选宿主因子CypB的互作蛋白[J]. 张頔,赵魁,周艳龙,赵宇航,钟嘉伟,崔珊珊,高丰,宋德光. 中国兽医学报. 2017(05)
[7]3种探究蛋白质互作实验技术简介[J]. 姚亭秀. 生物学通报. 2016(05)
[8]小麦中小GTP结合蛋白基因TaRop2克隆及其表达分析[J]. 李媛媛,安艳秋,王凤涛,冯晶,蔺瑞明,陈万权,徐世昌. 植物遗传资源学报. 2015(02)
[9]弓形虫CDPK1-EF基因的克隆与原核表达[J]. 刘思嘉,徐前明,李培英. 畜牧与兽医. 2014(02)
[10]双分子荧光互补技术的应用与展望[J]. 史彦薇,孔建强,安建梅. 药物生物技术. 2013(05)
博士论文
[1]与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定[D]. 王一凡.华中农业大学 2015
[2]华北大黑鳃金龟嗅觉相关蛋白互作机制研究[D]. 王冰.中国农业科学院 2013
[3]一种新的hTERT相互作用蛋白的筛选及鉴定[D]. 周丽娜.第三军医大学 2013
硕士论文
[1]Ig样结构域对嗜热酯酶Tn0664的影响[D]. 郝薇薇.吉林大学 2017
[2]柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建及钙依赖蛋白激酶3相互作用蛋白的筛选[D]. 徐帅兵.中国农业科学院 2017
[3]柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4功能特性的初步研究[D]. 王自文.中国农业科学院 2016
[4]二穗短柄草BdCDPK4和BdCDPK14基因的克隆、表达分析及遗传转化研究[D]. 赵旭东.华中科技大学 2015
[5]柔嫩艾美耳球虫微线蛋白与宿主表皮生长因子受体相互作用的研究[D]. 杨拓.吉林大学 2014
[6]基于荧光蛋白的蛋白酶和蛋白激酶检测新方法[D]. 王茗.湖南大学 2013
[7]柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶的研究[D]. 李洋.中国农业科学院 2010
[8]CDPK4亚细胞定位、超表达和RNAi载体构建与辣椒转化[D]. 朱万里.福建农林大学 2010
本文编号：3012718
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