外二醇双加氧酶Tc3516的定点突变、性质表征及应用
发布时间：2021-02-06 06:52
外二醇双加氧酶是一类广泛存在于自然界中,能够裂解多种芳烃类底物的酶。外二醇双加氧酶主要依赖金属离子来完成催化,能够有效除去环境中累积的有毒邻苯二酚类污染物质,对环境的修复具有积极意义。同时,外二醇双加氧酶可应用于工业加工、石油冶炼、生物制药等多个与芳香烃密切相关的领域,并清除其生产过程中产生的难以降解的芳香烃类物质,该过程是工业生产与排污治理的不可或缺的一个环节。双加氧酶Tc3516的基因来自高温单胞菌属Thermomonospora curvata,通过连接质粒pET-28a构建表达载体,并转化进入表达菌E.coli BL21（DE3）中表达蛋白。随后通过Ni2+-NTA亲和层析纯化目的蛋白,并进行性质表征。经检测,Tc3516的最适底物为3-甲基邻苯二酚,最适反应温度为50℃,最适反应缓冲液为50mM、pH为9的Gly-NaOH,在最适反应条件下测得酶的比活力为3.70 U/mg。为特异性提高该酶对3-甲基邻苯二酚的催化活力,对蛋白受体与底物配体进行了结构模拟与分子对接,并根据对接结果,在酶的活性位点附近根据“增大氨基酸疏水性,减少氨基酸残基的空间位阻”原则选...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 双加氧酶概述
1.3 外二醇双加氧酶的分类
1.4 外二醇双加氧酶的结构
1.5 外二醇双加氧酶的催化机制
1.6 基因水平上进行酶分子的改造
1.6.1 定向进化
1.6.2 定点突变
1.7 双加氧酶的应用现状
1.7.1 利用表达双加氧酶的微生物降解酚类污染物
1.7.2 制成生物传感器检测环境中的酚类污染物
1.8 双加氧酶固定化方面的研究
1.9 本课题研究内容与意义
第二章 双加氧酶Tc3516与底物的分子对接以及突变位点的选择
2.1 引言
2.2 配体、受体结构的获取
2.2.1 获取配体结构
2.2.2 获取受体结构——同源建模
2.2.2.1 I-TASSER结构模拟
2.2.2.2 Easy Modeller同源模建
2.3 确立受体蛋白的对接范围
2.4 进行分子对接
2.5 结果与讨论
2.5.1 Tc3516 与各突变体分子对接结果比较
2.5.1.1 Tc3516与F301V
2.5.1.2 Tc3516与D285A
2.5.1.3 Tc3516与W292V
2.5.1.4 Tc3516与D262A
2.5.1.5 Tc3516与R256A
2.5.1.6 Tc3516与H205V
2.5.2 Docking相关参数
2.5.2.1 受体结构模拟时的自由能
2.5.2.2 突变前后氨基酸残基与底物之间的距离及疏水性
2.5.2.3 受体二级结构性质参数
2.6 小结
第三章 外二醇双加氧酶Tc3516 与突变体的构建、表达和纯化
3.1 引言
3.2 实验仪器与材料
3.2.1 实验仪器
3.2.2 实验材料
3.3 实验方法
3.3.1 基因组提取
3.3.2 双加氧酶Tc3516 与突变体的构建
3.3.2.1 双加氧酶Tc3516 基因与突变体的克隆
3.3.2.2 双加氧酶与突变体重组质粒的构建
3.3.2.3 转化与测序
3.3.3 双加氧酶与突变体的表达与纯化
3.4 结果与讨论
3.4.1 Tc3516 基因与突变体PCR、纯化回收结果
3.4.2 载体pET28a酶切及纯化
3.4.3 重组质粒鉴定与测序
3.4.4 蛋白优化结果
2+-NTA亲和层析"> 3.4.5 Ni2+-NTA亲和层析
3.5 小结
第四章 双加氧酶Tc3516 及突变体的酶学性质表征
4.1 引言
4.2 实验仪器与材料
4.2.1 实验仪器
4.2.2 实验材料
4.3 实验方法
4.3.1 双加氧酶活力测定方法
4.3.2 双加氧酶Tc3516 及突变体底物特异性的测定
4.3.3 双加氧酶Tc3516 及突变体最适p H的测定
4.3.4 双加氧酶Tc3516 及突变体最适温度的测定
4.3.5 双加氧酶Tc3516 及突变体热稳定性的探究
4.3.6 双加氧酶Tc3516 及突变体反应动力学参数测定
4.4 结果与讨论
4.4.1 反应进程曲线
4.4.2 底物特异性测定结果
4.4.3 最适pH测定结果
4.4.4 最适温度测定结果
4.4.5 热稳定性测定结果
4.4.6 动力学参数测定结果
4.5 小结
第五章 基于最优突变体D285A的物理吸附固定化及连续流动反应器的制备
5.1 引言
5.2 实验仪器与材料
5.2.1 实验仪器
5.2.2 实验材料
5.2.2.1 载体材料
5.2.2.2 试剂
5.2.2.3 溶液配制
5.3 实验方法
5.3.1 D285A与载体SBA-15 固定化
5.3.2 固定化酶热稳定性检测
5.3.3 连续流动反应器的制作及操作过程
5.3.4 高效液相色谱（HPLC）检测污水处理率
5.4 结果与讨论
5.4.1 固定化酶的固定效率及温度稳定性
5.4.2 HPLC检测连续流动反应器的污水处理能力
5.4.2.1 底物浓度与峰面积的线性拟合
5.4.2.2 流速与重复利用次数对污水处理率的影响
5.4.2.3 底物水解量与固定化酶活
5.5 小结
全文总结
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]大豆过敏原11S球蛋白G2中A2链结合表位的预测[J]. 刘阳星月,张迪,姚亚亚,苗字叶,刘壮,李慧静. 食品科学. 2018(18)
[2]细菌芳烃外二醇双加氧酶研究进展[J]. 许炳雯,李诗阳,张强,曲媛媛,马桥,李新亮,周集体,张旭旺,周豪. 应用与环境生物学报. 2012(05)
[3]生物酶的定向进化及其应用[J]. 曾家豫,杨国兵,廖世奇. 卫生职业教育. 2007(23)
[4]石油污染土壤中芳烃降解菌及邻苯二酚2,3双加氧酶的克隆[J]. 吴宇澄,骆永明,滕应,刘五星,李振高. 土壤. 2006(05)
[5]芳香烃双加氧酶的结构与功能研究[J]. 章俭,夏春谷. 化学进展. 2004(01)
[6]点突变Pro229Ser和Glu243Gly对耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶性质的影响[J]. 姜涛,季朝能,盛小禹,毛裕民. 遗传学报. 2001(03)
[7]耐热邻苯二酚2,3双加氧酶的随机突变研究[J]. 季朝能,徐明,姜涛,金詟,盛小禹,毛裕民. 云南大学学报(自然科学版). 1999(S3)
[8]“复关”后进口冲击波的行业解析和对策[J]. 王赋,于培伟,张树淼. 科技导报. 1993(06)
博士论文
[1]基于受体和配体策略的计算机辅助农药生物合理设计研究[D]. 姚停停.浙江大学 2017
[2]大麦籽粒抗冻蛋白的制备及抗冻机制的研究[D]. 丁香丽.江南大学 2015
[3]耐热对硝基苯酚磷酸酶的晶体结构及其热稳定机制的研究[D]. 郭政.复旦大学 2013
本文编号：3020343
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 双加氧酶概述
1.3 外二醇双加氧酶的分类
1.4 外二醇双加氧酶的结构
1.5 外二醇双加氧酶的催化机制
1.6 基因水平上进行酶分子的改造
1.6.1 定向进化
1.6.2 定点突变
1.7 双加氧酶的应用现状
1.7.1 利用表达双加氧酶的微生物降解酚类污染物
1.7.2 制成生物传感器检测环境中的酚类污染物
1.8 双加氧酶固定化方面的研究
1.9 本课题研究内容与意义
第二章 双加氧酶Tc3516与底物的分子对接以及突变位点的选择
2.1 引言
2.2 配体、受体结构的获取
2.2.1 获取配体结构
2.2.2 获取受体结构——同源建模
2.2.2.1 I-TASSER结构模拟
2.2.2.2 Easy Modeller同源模建
2.3 确立受体蛋白的对接范围
2.4 进行分子对接
2.5 结果与讨论
2.5.1 Tc3516 与各突变体分子对接结果比较
2.5.1.1 Tc3516与F301V
2.5.1.2 Tc3516与D285A
2.5.1.3 Tc3516与W292V
2.5.1.4 Tc3516与D262A
2.5.1.5 Tc3516与R256A
2.5.1.6 Tc3516与H205V
2.5.2 Docking相关参数
2.5.2.1 受体结构模拟时的自由能
2.5.2.2 突变前后氨基酸残基与底物之间的距离及疏水性
2.5.2.3 受体二级结构性质参数
2.6 小结
第三章 外二醇双加氧酶Tc3516 与突变体的构建、表达和纯化
3.1 引言
3.2 实验仪器与材料
3.2.1 实验仪器
3.2.2 实验材料
3.3 实验方法
3.3.1 基因组提取
3.3.2 双加氧酶Tc3516 与突变体的构建
3.3.2.1 双加氧酶Tc3516 基因与突变体的克隆
3.3.2.2 双加氧酶与突变体重组质粒的构建
3.3.2.3 转化与测序
3.3.3 双加氧酶与突变体的表达与纯化
3.4 结果与讨论
3.4.1 Tc3516 基因与突变体PCR、纯化回收结果
3.4.2 载体pET28a酶切及纯化
3.4.3 重组质粒鉴定与测序
3.4.4 蛋白优化结果
2+-NTA亲和层析"> 3.4.5 Ni2+-NTA亲和层析
3.5 小结
第四章 双加氧酶Tc3516 及突变体的酶学性质表征
4.1 引言
4.2 实验仪器与材料
4.2.1 实验仪器
4.2.2 实验材料
4.3 实验方法
4.3.1 双加氧酶活力测定方法
4.3.2 双加氧酶Tc3516 及突变体底物特异性的测定
4.3.3 双加氧酶Tc3516 及突变体最适p H的测定
4.3.4 双加氧酶Tc3516 及突变体最适温度的测定
4.3.5 双加氧酶Tc3516 及突变体热稳定性的探究
4.3.6 双加氧酶Tc3516 及突变体反应动力学参数测定
4.4 结果与讨论
4.4.1 反应进程曲线
4.4.2 底物特异性测定结果
4.4.3 最适pH测定结果
4.4.4 最适温度测定结果
4.4.5 热稳定性测定结果
4.4.6 动力学参数测定结果
4.5 小结
第五章 基于最优突变体D285A的物理吸附固定化及连续流动反应器的制备
5.1 引言
5.2 实验仪器与材料
5.2.1 实验仪器
5.2.2 实验材料
5.2.2.1 载体材料
5.2.2.2 试剂
5.2.2.3 溶液配制
5.3 实验方法
5.3.1 D285A与载体SBA-15 固定化
5.3.2 固定化酶热稳定性检测
5.3.3 连续流动反应器的制作及操作过程
5.3.4 高效液相色谱（HPLC）检测污水处理率
5.4 结果与讨论
5.4.1 固定化酶的固定效率及温度稳定性
5.4.2 HPLC检测连续流动反应器的污水处理能力
5.4.2.1 底物浓度与峰面积的线性拟合
5.4.2.2 流速与重复利用次数对污水处理率的影响
5.4.2.3 底物水解量与固定化酶活
5.5 小结
全文总结
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]大豆过敏原11S球蛋白G2中A2链结合表位的预测[J]. 刘阳星月,张迪,姚亚亚,苗字叶,刘壮,李慧静. 食品科学. 2018(18)
[2]细菌芳烃外二醇双加氧酶研究进展[J]. 许炳雯,李诗阳,张强,曲媛媛,马桥,李新亮,周集体,张旭旺,周豪. 应用与环境生物学报. 2012(05)
[3]生物酶的定向进化及其应用[J]. 曾家豫,杨国兵,廖世奇. 卫生职业教育. 2007(23)
[4]石油污染土壤中芳烃降解菌及邻苯二酚2,3双加氧酶的克隆[J]. 吴宇澄,骆永明,滕应,刘五星,李振高. 土壤. 2006(05)
[5]芳香烃双加氧酶的结构与功能研究[J]. 章俭,夏春谷. 化学进展. 2004(01)
[6]点突变Pro229Ser和Glu243Gly对耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶性质的影响[J]. 姜涛,季朝能,盛小禹,毛裕民. 遗传学报. 2001(03)
[7]耐热邻苯二酚2,3双加氧酶的随机突变研究[J]. 季朝能,徐明,姜涛,金詟,盛小禹,毛裕民. 云南大学学报(自然科学版). 1999(S3)
[8]“复关”后进口冲击波的行业解析和对策[J]. 王赋,于培伟,张树淼. 科技导报. 1993(06)
博士论文
[1]基于受体和配体策略的计算机辅助农药生物合理设计研究[D]. 姚停停.浙江大学 2017
[2]大麦籽粒抗冻蛋白的制备及抗冻机制的研究[D]. 丁香丽.江南大学 2015
[3]耐热对硝基苯酚磷酸酶的晶体结构及其热稳定机制的研究[D]. 郭政.复旦大学 2013
本文编号：3020343
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