莱茵衣藻二脂酰甘油酰基转移酶启动子对逆境的应答研究
发布时间：2021-03-14 11:19
随着目前雾霾等环境问题的日益严峻,不管是从能源的安全问题还是从减少空气污染物排放来看,对可再生资源的研究显得至关重要。微藻又以其生长速度快、占地面积小、单位产油量高等诸多优点成为生产生物柴油非常有优势的原料,其油脂代谢途径以及如何增加产油量也成为近年来研究的热点。本文对莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）油脂代谢途径中三酰甘油TAG合成的最后一步关键酶二脂酰甘油酰基转移酶基因CrDGAT1、CrDGAT2-1、CrDGAT2-5的启动子进行研究。首先实验研究了在缺氮、缺硫和缺磷的逆境条件下,莱茵衣藻的生物量和油脂含量的变化,结果发现,缺氮、缺硫、缺磷有利于莱茵衣藻油脂的积累,但是会导致生物量相应的减少。同时Real time PCR也发现,CrDGAT1、CrDGAT2-1、 CrDGAT2-5在HSM-P、低温和HSM-N培养的CC425藻株中mRNA表达量也较正常HSM培养时高。实验通过构建一系列CrDGAT1、CrDGAT2-1、CrDGAT2-5启动子片段的缺失载体,转入C. Reinhardtii CC425,检测报告基因ARS的酶活性。结果显示,在...
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 微藻生物质能源研究背景
1.1.1 日益严峻的能源危机与环境问题
1.1.2 生物质能与能源微藻
1.1.3 能源微藻产油的优势与存在的问题
1.2 微藻油脂积累的特点及影响因素
1.2.1 微藻产油的过程
1.2.2 营养元素（Nutrients）对油脂积累的影响
1.2.3 温度（Temperature）对微藻油脂积累的影响
1.3 实验藻株的选择
1.4 实验基因的选择
1.4.1 二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT）
1.4.2 二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT）的生物信息学分析
1.5 基因研究采用的关键技术
1.5.1 基因克隆技术
1.5.2 RealTime-PCR（实时荧光定量PCR）技术
1.6 研究目的与意义
1.7 技术路线
2 实验材料与方法
2.1 实验材料与试剂
2.1.1 实验微藻
2.1.2 实验仪器
2.1.3 工程菌株及载体
2.1.4 实验用试剂
2.1.5 实验主要培养基的配制
2.1.6 实验中设计的引物序列
2.2 实验方法
2.2.1 莱茵衣藻在HSM-N,HSM-P,HSM-S条件下生理生化反应
2.2.2 CrDGAT1、CrDGAT2-1、CrDGAT2-5启动子全长的克隆
2.2.3 CrDGAT1、CrDGAT2-1、CrDGAT2-5启动子删减片段的克隆
2.2.4 阳性克隆载体与pArg7.8共转化莱茵衣藻CC425
2.2.5 转化子启动子应答条件的筛选
2.2.6 启动子应答区域逐步突变克隆载体构建与顺式作用元件的确定
2.2.7 SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR分析野生藻株以及转化藻株在逆境条件的基因表达
3 实验结果
3.1 莱茵衣藻CC124和CC425在缺氮、缺硫条件下生理生化指标
3.1.1 藻株在缺氮、缺硫条件下生物量变化
3.1.2 藻株在缺氮、缺硫条件下油脂含量变化
3.1.3 藻株在缺氮、缺硫条件下藻状态及油滴显微拍照
3.2 莱茵衣藻CrDGAT1,DGAT2-1,DGAT2-5启动子全长的克隆
3.2.1 莱茵衣藻CC425总DNA的提取
3.2.2 CrDGAT1,DGAT2-1,DGAT2-5启动子全长片段扩增
3.2.3 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5启动子全长片段与pMD18-T载体连接、转化、阳性克隆筛选
3.2.4 测序结果分析
3.3 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5启动子5’和3’端逐步缺失片段的克隆
3.3.1 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5启动子缺失片段的扩增
3.3.2 CrDGAT1,DGAT2-1,DGAT2-5启动子缺失片段较长片段的克隆
3.4 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5启动子长缺失片段转化CC425藻株,确定转化子反应的逆境条件
3.5 CrDGA T2-1启动子缺失片段克隆载体的构建与数据分析
3.5.1 CrDGAT2-1启动子缺失片段克隆载体的构建
3.5.2 转化子藻株ARS酶活性分析
3.6 CrDGAT2-1启动子-319,-247段逐步突变克隆载体构建与数据分析
3.6.1 CrDGAT2-1启动子-319,-247段逐步突变引物设计
3.6.2 CrDGAT2-1启动子-319,-247段逐段突变克隆载体的构建
3.7 SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5 mRNA表达水平
3.7.1 在CC425正常,HSM-P,低温；CC124正常,HSM-N,条件下CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5 mRNA表达水平
3.7.2 CrDGAT2-1启动子在转化藻种的mRNA表达量
4 讨论
4.1 关于启动子反应逆境条件的选择
4.2 关于启动子应答反应区域的确定
4.3 qRT-PCR分析基因的表达
5 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国生物质能源发展现状与战略思考[J]. 闫金定. 林产化学与工业. 2014(04)
[2]微藻三酰甘油合成途径及其最新研究进展[J]. 何思思,王元丽,高保燕,万凌琳,李爱芬,张成武. 生命科学. 2014(09)
[3]能源危机、环境污染与我国绿色会计发展的研究[J]. 步瑞. 中国乡镇企业会计. 2014(06)
[4]抗逆基因AtRPK1启动子关键顺式作用元件的研究[J]. 石翠翠,李晓旭,李晶岚,任亚楠,张福臻,黄占景,葛荣朝. 植物研究. 2014(03)
[5]龙眼胚性愈伤组织DlRan3A和DlRan3B基因启动子的克隆及其生物信息学分析[J]. 田奇琳,林玉玲,赖钟雄,王天池. 热带作物学报. 2014(01)
[6]莱茵衣藻中Limp77基因干涉后油脂含量升高[J]. 王蒙,费小雯,徐立新,邓晓东. 中国生物化学与分子生物学报. 2013(12)
[7]缺氮条件对栅藻油脂积累与光合作用的影响[J]. 刘金丽,王俊峰,刘天中,高莉丽. 海洋科学. 2013(07)
[8]激素IAA和ABA对小球藻（Chlorella sp.）生长和油脂积累的影响[J]. 邓晓东,吴小霞,范新照,费小雯,任大明. 中国油料作物学报. 2013(01)
[9]营养限制对Heynigia riparia CE14-2油脂积累的影响[J]. 费小雯,蔡佳佳,邓晓东. 安徽农业科学. 2012(34)
[10]莱茵衣藻氮胁迫基因数字表达谱分析[J]. 李亚军,费小雯,邓晓东. 热带农业科学. 2012(11)
硕士论文
[1]莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）油脂合成相关基因的功能研究[D]. 蔡佳佳.海南大学 2012
本文编号：3082077
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 微藻生物质能源研究背景
1.1.1 日益严峻的能源危机与环境问题
1.1.2 生物质能与能源微藻
1.1.3 能源微藻产油的优势与存在的问题
1.2 微藻油脂积累的特点及影响因素
1.2.1 微藻产油的过程
1.2.2 营养元素（Nutrients）对油脂积累的影响
1.2.3 温度（Temperature）对微藻油脂积累的影响
1.3 实验藻株的选择
1.4 实验基因的选择
1.4.1 二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT）
1.4.2 二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT）的生物信息学分析
1.5 基因研究采用的关键技术
1.5.1 基因克隆技术
1.5.2 RealTime-PCR（实时荧光定量PCR）技术
1.6 研究目的与意义
1.7 技术路线
2 实验材料与方法
2.1 实验材料与试剂
2.1.1 实验微藻
2.1.2 实验仪器
2.1.3 工程菌株及载体
2.1.4 实验用试剂
2.1.5 实验主要培养基的配制
2.1.6 实验中设计的引物序列
2.2 实验方法
2.2.1 莱茵衣藻在HSM-N,HSM-P,HSM-S条件下生理生化反应
2.2.2 CrDGAT1、CrDGAT2-1、CrDGAT2-5启动子全长的克隆
2.2.3 CrDGAT1、CrDGAT2-1、CrDGAT2-5启动子删减片段的克隆
2.2.4 阳性克隆载体与pArg7.8共转化莱茵衣藻CC425
2.2.5 转化子启动子应答条件的筛选
2.2.6 启动子应答区域逐步突变克隆载体构建与顺式作用元件的确定
2.2.7 SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR分析野生藻株以及转化藻株在逆境条件的基因表达
3 实验结果
3.1 莱茵衣藻CC124和CC425在缺氮、缺硫条件下生理生化指标
3.1.1 藻株在缺氮、缺硫条件下生物量变化
3.1.2 藻株在缺氮、缺硫条件下油脂含量变化
3.1.3 藻株在缺氮、缺硫条件下藻状态及油滴显微拍照
3.2 莱茵衣藻CrDGAT1,DGAT2-1,DGAT2-5启动子全长的克隆
3.2.1 莱茵衣藻CC425总DNA的提取
3.2.2 CrDGAT1,DGAT2-1,DGAT2-5启动子全长片段扩增
3.2.3 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5启动子全长片段与pMD18-T载体连接、转化、阳性克隆筛选
3.2.4 测序结果分析
3.3 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5启动子5’和3’端逐步缺失片段的克隆
3.3.1 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5启动子缺失片段的扩增
3.3.2 CrDGAT1,DGAT2-1,DGAT2-5启动子缺失片段较长片段的克隆
3.4 CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5启动子长缺失片段转化CC425藻株,确定转化子反应的逆境条件
3.5 CrDGA T2-1启动子缺失片段克隆载体的构建与数据分析
3.5.1 CrDGAT2-1启动子缺失片段克隆载体的构建
3.5.2 转化子藻株ARS酶活性分析
3.6 CrDGAT2-1启动子-319,-247段逐步突变克隆载体构建与数据分析
3.6.1 CrDGAT2-1启动子-319,-247段逐步突变引物设计
3.6.2 CrDGAT2-1启动子-319,-247段逐段突变克隆载体的构建
3.7 SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5 mRNA表达水平
3.7.1 在CC425正常,HSM-P,低温；CC124正常,HSM-N,条件下CrDGAT1,CrDGAT2-1,CrDGAT2-5 mRNA表达水平
3.7.2 CrDGAT2-1启动子在转化藻种的mRNA表达量
4 讨论
4.1 关于启动子反应逆境条件的选择
4.2 关于启动子应答反应区域的确定
4.3 qRT-PCR分析基因的表达
5 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国生物质能源发展现状与战略思考[J]. 闫金定. 林产化学与工业. 2014(04)
[2]微藻三酰甘油合成途径及其最新研究进展[J]. 何思思,王元丽,高保燕,万凌琳,李爱芬,张成武. 生命科学. 2014(09)
[3]能源危机、环境污染与我国绿色会计发展的研究[J]. 步瑞. 中国乡镇企业会计. 2014(06)
[4]抗逆基因AtRPK1启动子关键顺式作用元件的研究[J]. 石翠翠,李晓旭,李晶岚,任亚楠,张福臻,黄占景,葛荣朝. 植物研究. 2014(03)
[5]龙眼胚性愈伤组织DlRan3A和DlRan3B基因启动子的克隆及其生物信息学分析[J]. 田奇琳,林玉玲,赖钟雄,王天池. 热带作物学报. 2014(01)
[6]莱茵衣藻中Limp77基因干涉后油脂含量升高[J]. 王蒙,费小雯,徐立新,邓晓东. 中国生物化学与分子生物学报. 2013(12)
[7]缺氮条件对栅藻油脂积累与光合作用的影响[J]. 刘金丽,王俊峰,刘天中,高莉丽. 海洋科学. 2013(07)
[8]激素IAA和ABA对小球藻（Chlorella sp.）生长和油脂积累的影响[J]. 邓晓东,吴小霞,范新照,费小雯,任大明. 中国油料作物学报. 2013(01)
[9]营养限制对Heynigia riparia CE14-2油脂积累的影响[J]. 费小雯,蔡佳佳,邓晓东. 安徽农业科学. 2012(34)
[10]莱茵衣藻氮胁迫基因数字表达谱分析[J]. 李亚军,费小雯,邓晓东. 热带农业科学. 2012(11)
硕士论文
[1]莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）油脂合成相关基因的功能研究[D]. 蔡佳佳.海南大学 2012
本文编号：3082077
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