矮沙冬青甜菜碱醛脱氢酶基因（AnBADH）转化烟草及其对耐旱和耐盐性的改良

发布时间：2017-04-17 02:18

  本文关键词：矮沙冬青甜菜碱醛脱氢酶基因（AnBADH）转化烟草及其对耐旱和耐盐性的改良，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：干旱和土壤盐渍化等非生物逆境,严重制约了作物生长发育和地理分布,是造成农作物产量下降甚至绝收的原因之一。提高作物抵抗逆境胁迫的能力,具有重要的理论和现实意义。植物为了适应或抵抗不利环境,在进化过程中逐步形成了一定的抗逆机制来减轻胁迫伤害。矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus)与蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongollcus)同属豆科沙冬青属,是第三纪古地中海消失后,在气候旱化过程中逐渐适应,并在塔里木盆地西部幸存下来的残遗物种。对其干旱瘠薄的恶劣环境有极强的适应性,是我国西部荒漠地区唯一常绿阔叶灌木。克隆矮沙冬青抗逆相关基因,异源转化表达验证其功能,可为抗逆转基因育种提供基因资源。本实验用前期克隆的矮沙冬青甜菜碱醛脱氢酶基因AnBADH,构建双子叶植物表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型烟草品系“W38”,对转基因烟草株系进行抗逆相关测定,得到如下结果：1.通过农杆菌介导法转化烟草,经潮霉素初步筛选后获得58个抗性植株,PCR检测鉴定,其中20个植株为阳性,扩增条带大小和质粒一致,说明AnBADH基因插入到烟草基因组中。2.选取H13、H16和H22三个阳性转基因烟草T1株系的种子,在含有20 mg·L-1潮霉素的MS培养基上做发芽试验,分别并移栽至含有200 mmol·L-1 NaCl和200 mmol·L-1甘露醇的MS固体培养基上,模拟高盐、干旱胁迫,观察测定其形态变化。结果表明,转AnBADH基因烟草株系的幼苗在干旱和高盐胁迫胁迫条件下均能够正常生长,与野生型对照相比,植株健壮,侧根发达,根系更长,具有一定抵抗干旱和高盐胁迫的能力。3.经抗生素筛选和PCR检测的H13、H16和H22的T1代阳性株系,用10%的聚乙二醇6000和300 mmol·L-1的NaCl模拟干旱和高盐胁迫,测定叶片的相对电导率,以及叶片中甜菜碱、游离脯氨酸、丙二醛和可溶性糖的含量。结果表明,干旱胁迫下转基因和野生型植株甜菜碱含量差异不明显,转基因株系可溶性糖含量明显增加,转基因H13和H16两个株系的游离脯氨酸含量增加,H22株系的丙二醛含量在胁迫之后明显降低,转基因株系相对电导率在干旱胁迫第2d和第3d显著低于野生型对照。高盐胁迫下,转基因和野生型植株甜菜碱含量变化差异不明显,转基因株系可溶性糖含量明显增加,游离脯氨酸含量均有所上升,而丙二醛含量明显减少。转基因株系相对电导率在高盐胁迫第2d显著低于野生型对照。4.在自然干旱条件下,转基因烟草株系耐受能力强于野生型,在干旱处理28d后,上部叶片仍然保持绿色,而野生型对照呈现严重脱水症状。复水后转基因株系能够迅速恢复正常生长,叶片挺立,但野生型植株叶片仍呈萎焉状态。从上述几方面的试验结果看,转化AnBADH基因的烟草株系在干旱和高盐胁迫下,细胞能迅速积累渗透调节物质,细胞膜过氧化程度减轻,透性降低,植物耐受性增强,说明克隆的矮沙冬青甜菜碱醛脱氢酶基因AnBADH具有较好的抗逆功能,进一步验证后可用于作物转基因改良。
【关键词】：BADH基因 转基因 烟草 沙冬青 功能
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1 文献综述10-20
• 1.1 矮沙冬青10-14
• 1.1.1 沙冬青抗逆生理生化特性10-12
• 1.1.2 沙冬青抗逆基因克隆与功能验证12-14
• 1.2 植物耐盐、抗旱机理14-17
• 1.2.1 植物耐盐机理14-15
• 1.2.2 植物耐旱机理15-17
• 1.3 甜菜碱的生理生化特性及作用机理17-20
• 1.3.1 甜菜碱生理生化特性17
• 1.3.2 外源甜菜碱对植物的作用17-18
• 1.3.3 植物体内甜菜碱合成途径18-19
• 1.3.4 甜菜碱与基因工程19-20
• 1.4 本研究的目的和意义20
• 2 材料和方法20-29
• 2.1 材料20-23
• 2.2 方法23-29
• 2.2.1 烟草无菌苗的培养23
• 2.2.2 农杆菌的活化23
• 2.2.3 受体材料的准备及转化23-24
• 2.2.4 转化植株的培养24
• 2.2.5 T_0烟草植株PCR检测24-25
• 2.2.6 转基因烟草种子抗生素筛选25
• 2.2.7 T_1烟草植株PCR检测25-26
• 2.2.8 T_1烟草植株RT-PCR检测26
• 2.2.9 转基因烟草幼苗逆境胁迫处理26
• 2.2.10 转基因烟草植株生理指标测定26-29
• 3 结果与分析29-44
• 3.1 烟草无菌苗29-30
• 3.2 T_0烟草植株PCR检测30
• 3.3 T_1代烟草株系种子抗生素筛选30-31
• 3.4 T_1株系PCR检测31-33
• 3.5 T_1株系RT-PCR检测33-34
• 3.6 转基因烟草株系幼苗抗逆性34-36
• 3.6.1 转基因烟草株系幼苗抗盐性34-35
• 3.6.2 转基因烟草株系幼苗抗旱性35-36
• 3.7 转基因烟草株系抗逆性36-44
• 3.7.1 T_1代株系在干旱胁迫下的生理指标36-40
• 3.7.2 T_1代株系在高盐胁迫下的生理指标40-43
• 3.7.3 T_1代株系的抗旱性43-44
• 4 讨论44-47
• 4.1 矮沙冬青AnBADH遗传转化44-45
• 4.2 转AnBADH基因烟草苗期抗逆性45
• 4.3 转基因烟草对干旱、盐渍抗逆特性45-46
• 4.4 小结46-47
• 5 参考文献47-54
• 6 致谢54

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