胞嘧啶脱氨基化酶APOBEC1及其辅因子的体外制备与结晶条件初筛

发布时间：2021-04-21 08:32

　　本论文分为两个部分。本文第一部分工作,载脂蛋白B m RNA编辑酶,催化多肽-1,即APOBEC1（Apolipoprotein B m RNA editing enzyme,catalytic polypeptide 1,简称A1）是APOBEC家族成员,在辅助因子A1CF（APOBEC1 complemetation factor）和/或RNA结合模体蛋白RBM47（RNA binding motif protein 47）的存在下特异性结合载脂蛋白B m RNA（Apolipoprotein B m RNA,Apo B m RNA）并催化脱氨基化第6666位胞嘧啶（C6666）转变为尿嘧啶（U6666）,产生载脂蛋白B截短体Apo B48,从而参与调控与脂质代谢相关的生理过程,但具体机理不清楚。此外,A1还调控多种细胞因子转录物的表达进而参与肿瘤病变,或编辑病毒基因组从而抑制部分逆转录病毒的复制。为了后期结构解析及药物筛选需要,侧重APOBEC1、A1CF及RBM47样品制备与结晶条件初筛。为此我们尝试了多种表达质粒及优化蛋白纯化方法后,发现常规的表达体系中A1通常以包涵体形式表... 

【文章来源】：上海师范大学上海市

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 研究背景及意义
        1.1.1 AID
        1.1.2 APOBEC2
        1.1.3 APOBEC3
        1.1.4 APOBEC4
        1.1.5 APOBEC1
        1.1.6 A1 辅助蛋白A1CF及 RBM
    1.2 国内外研究进展
        1.2.1 APOBEC1 结构研究
        1.2.2 APOBEC1 催化ApoB mRNA胞嘧啶脱氨机制研究
        1.2.3 APOBEC1 其他功能研究
        1.2.4 辅助蛋白功能研究
    1.3 论文立意
第2章 实验材料与方法
    2.1 主要试剂与耗材
    2.2 实验仪器
    2.3 实验材料配制
        2.3.1 蛋白表达纯化相关溶液
        2.3.2 蛋白纯化缓冲溶液
        2.3.3 凝胶电泳相关溶液
        2.3.4 超级感受态的制备
    2.4 质粒构建的材料与方法
        2.4.1 引物信息
        2.4.2 实验方法
第3章 A1的表达纯化
    3.1 A1 表达方法探索
        3.1.1 A1 表达载体的设计与构建
        3.1.2 三种载体的小量表达
        3.1.3 应对A1 包涵体表达的4 种策略
    3.2 A1-pMAL表达载体的设计
    3.3 蛋白表达
        3.3.1 蛋白小量表达测试
        3.3.2 蛋白大量表达
    3.4 蛋白提取与纯化
        3.4.1 裂解细菌
        3.4.2 蛋白纯化与鉴定
    3.5 本章小结
第4章 辅助蛋白的表达纯化
    4.1 辅助蛋白的表达
        4.1.1 质粒设计与构建
        4.1.2 辅助蛋白小量表达
    4.2 辅助蛋白纯化
        4.2.1 A1CF纯化方法
        4.2.2 RBM47 纯化方法
    4.3 本章小结
第5章 辅助蛋白晶体筛选
    5.1 核酸制备
        5.1.1 核酸序列
        5.1.2 ApoB mRNA制备
    5.2 RBM47 荧光偏振实验
        5.2.1 样品准备
        5.2.2 实验结果
    5.3 晶体筛选
        5.3.1 结晶试剂与方法
        5.3.2 晶体筛选进展
    5.4 本章小结
第6章 氧化酶PrhA的改造
    6.1 课题背景与立意
    6.2 实验材料
        6.2.1 基本材料
        6.2.2 蛋白纯化缓冲液
    6.3 pET28a-PrhA-A232Y表达纯化
        6.3.1 pET28a-PrhA-A232Y载体构建与表达
        6.3.2 His-PrhA-A232Y纯化方法
    6.4 PrhA-A232Y活性测试
    6.5 本章小结
第7章 总结与讨论
    7.1 胞嘧啶脱氨基酶A1 及其辅助蛋白的制备与晶体初筛
    7.2 氧化酶PrhA的改造
参考文献
附录 缩略语
攻读学位期间取得的研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]胞嘧啶脱氨基化酶APOBEC3家族及其与核酸复合物结构研究进展[J]. 金交羽,严小璇,刘亚平,蓝文贤,王春喜,许斌,曹春阳.  化学学报. 2019(11)
[2]APOBEC3F蛋白的结构与功能[J]. 欧阳昌鑫,卢秀秀,赵玢,蓝文贤,朱爱萍.  生命的化学. 2014(06)



本文编号：3151423