果蝇刚毛调控基因extramacrochaetae上游顺式调控元件的鉴定

发布时间：2017-07-07 03:08

  本文关键词：果蝇刚毛调控基因extramacrochaetae上游顺式调控元件的鉴定

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【摘要】：协同进化表现在生物学不同层面上,在微观上基因表达的协同进化中,顺-反式调控的协同进化已有大量研究,但对同一转录因子结合不同顺式调控元件,多基因调控的协同进化研究甚少。为了研究多基因调控的协同进化,本研究以果蝇背板刚毛作为表型标记进行研究。果蝇粗刚毛(macrochaetae)的发育受原神经基因achaete-scute(ac-sc)的主导,ac-sc基因受到上游基因激活而表达在刚毛生长的部位。在ac-sc的调控网络中,果蝇extramacrochaetae(emc)基因能够抑制sc基因履行正常的功能,进而抑制粗刚毛的形成,因此emc表达在没有刚毛生长的部位。果蝇sc基因的转录能被刚毛调控基因Pannier(pnr)和Iroquois complex(iro-C)激活,但emc基因的转录调控机制尚不清楚,有研究发现在pnr与iro-C突变的果蝇中,emc表达水平变化,鉴于emc和sc基因表达模式的互补性,推测emc也受到pnr与iro-C的调控,emc和sc应答相同的反式调控模式,在刚毛发育中这两个基因的调控将协同进化。为了验证果蝇emc基因是否也受到pnr与iro-C的调控,本研究主要专注于对emc基因上游顺式调控序列的鉴别和功能研究。鉴于此,本研究设计了一系列实验旨在验证pnr和iro-C基因是否会调控emc的表达,本研究的主要结果如下：(1)首先通过生物信息学方法分析了黑腹果蝇emc基因上游序列中的GATA. TAAT和ACAnnTGT序列,预测了潜在的Pnr结合位点(GATA)和Iro-C结合位点(TAAT和ACAnnTGT)；(2)分离克隆出果蝇emc基因上游含有GATA.TAAT和ACAnnTGT保守位点的非编码序列,构建emc基因调控序列的荧光素酶报告基因载体,通过转染细胞和检测荧光素酶活性,在体外利用荧光素酶报告基因系统鉴别出emc基因上游2.3 Kb处的顺式调控元件emcE6;(3)构建emcE6-EGFP报告基因转基因载体,通过显微注射构建得到顺式调控元件emcE6的转基因果蝇,在果蝇体内验证了潜在顺式调控元件emcE6的表达模式和调控活性；(4)GATA位点突变体的荧光素酶报告基因分析发现emcE6中一个潜在的Pnr结合位点具有调控活性,pnr基因参与emc的转录调控；(5)对TAAT位点突变体的荧光素酶报告基因分析发现所鉴定的顺式调控元件emcE6中潜在的Iro-C结合位点无调控活性,本研究表明Iro-C转录因子不参与emc的转录调控。综上所述,本研究试验结果表明在果蝇emc基因上游2.3 Kb处存在一个具有调控活性的顺式调控元件emcE6; emcE6中一个潜在的Pnr结合位点具有调控活性,调控emc的转录；转录因子Iro-C不参与emc的转录调控。本研究在分子水平上研究了果蝇刚毛调控基因emc的转录调控机制,揭示了果蝇DC刚毛发育有关基因emc与sc的调控将协同进化。本研究为进化发育生物学的研究提供了具体的事例,具有一定的理论创新性。
【关键词】：果蝇 刚毛 extramacrochaetae Pannier 顺式调控序列
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文符号说明9-13
• 1 文献综述13-28
• 1.1 模式生物果蝇13-14
• 1.2 果蝇顺式调控序列14-21
• 1.2.1 顺式调控序列简介15-16
• 1.2.2 顺式调控序列与果蝇刚毛16-18
• 1.2.3 顺式调控序列与果蝇色素沉积18-20
• 1.2.4 顺式调控序列与果蝇胚胎发育20-21
• 1.3 果蝇背板刚毛研究21-24
• 1.3.1 果蝇背板刚毛发育21-22
• 1.3.2 果蝇背板刚毛调控22-23
• 1.3.3 果蝇extramacrochaetae(emc)基因23-24
• 1.4 顺式调控序列研究方法24-27
• 1.4.1 荧光素酶报告基因分析25
• 1.4.2 增强子/报告基因(Enhancer/reporter)转基因果蝇25-27
• 1.5 研究的目的意义27-28
• 2 材料与方法28-45
• 2.1 试验材料28-31
• 2.1.1 试验动物28
• 2.1.2 试验菌株、细胞和载体28
• 2.1.3 主要试验试剂及配制28-30
• 2.1.3.1 果蝇培养试剂28
• 2.1.3.2 核酸提取试剂28-29
• 2.1.3.3 电泳相关试剂29
• 2.1.3.4 载体构建及点突变试剂29-30
• 2.1.3.5 细胞实验相关试剂30
• 2.1.3.6 其它试剂30
• 2.1.4 主要仪器30-31
• 2.2 试验方法31-45
• 2.2.1 果蝇emc基因上游序列生物信息分析31-32
• 2.2.1.1 果蝇emc基因上游非编码序列的获取31-32
• 2.2.1.2 果蝇emc潜在的Pnr和lro-C结合元件和结合位点预测32
• 2.2.2 果蝇基因组DNA提取和检测32-33
• 2.2.3 荧光素酶报告基因载体构建33-39
• 2.2.3.1 引物设计34
• 2.2.3.2 PCR扩增34-35
• 2.2.3.3 PCR产物的鉴定和胶回收35
• 2.2.3.4 TA连接反应35
• 2.2.3.5 转化35-36
• 2.2.3.6 TA克隆鉴定36-37
• 2.2.3.7 酶切37
• 2.2.3.8 连接37
• 2.2.3.9 转化和pGL3-hsp promoter重组菌落筛选37-38
• 2.2.3.10 pGL3-hsp promoter-emc Enhancer重组载体构建38-39
• 2.2.4 定点突变荧光素酶报告载体构建39-41
• 2.2.4.1 反向PCR39-40
• 2.2.4.2 Dpn I消化40
• 2.2.4.3 自身环化40
• 2.2.4.4 转化40-41
• 2.2.4.5 突变体鉴别41
• 2.2.5 细胞转染及荧光素酶检测41-43
• 2.2.5.1 HEK293T细胞复苏41
• 2.2.5.2 HEK293T细胞传代41-42
• 2.2.5.3 HEK293T细胞瞬时转染42-43
• 2.2.5.4 荧光素酶检测43
• 2.2.6 转基因果蝇品系构建及分析43-45
• 2.2.6.1 增强子-EGFP转基因载体构建43-44
• 2.2.6.2 显微注射及构建转基因果蝇44
• 2.2.6.3 转基因果蝇分析44-45
• 3 试验结果与分析45-54
• 3.1 果蝇emc基因上游潜在的Pnr和Iro-C结合位点45-49
• 3.2 调控序列荧光素酶报告基因载体49-50
• 3.3 荧光素酶报告基因分析结果50-53
• 3.4 构建转基因果蝇53
• 3.5 转基因果蝇翅原基(wing disc)中EGFP表达模式分析53-54
• 4 讨论54-58
• 4.1 果蝇emc基因上游保守非编码元件55
• 4.2 调控emc基因的顺式调控元件emcE655-56
• 4.3 Pnr参与emc基因的调控56-57
• 4.4 emc与sc基因调控的协同进化57
• 4.5 Iro-C与emc基因57-58
• 5 结论58
• 6 创新点与展望58-60
• 6.1 本研究主要创新点58
• 6.2 展望58-60
• 参考文献60-68
• 致谢68-69
• 攻读学位期间发表的学术论文目录69

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1 郝沛;余曜;张晓艳;屠康;范海威;钟扬;;顺式调控元件对“头对头”基因对共表达的影响[J];中国科学(C辑:生命科学);2008年11期

2 陈士友,蒋O，

本文编号：528656