日本七鳃鳗Fyn-like的基因编码区克

发布时间：2017-08-31 16:37

  本文关键词：日本七鳃鳗Fyn-like的基因编码区克隆、重组表达以及相关免疫学研究

  更多相关文章： 酪氨酸蛋白激酶Fyn-like 进化 日本七鳃鳗 免疫应答

【摘要】：Fyn基因是非受体型酪氨酸蛋白激酶Src家族成员之一,在细胞的生长、生存、凋亡、细胞与细胞之间的粘附以及免疫应答作用方面起到十分重要的作用。七鳃鳗是具有很高研究价值的模式生物,因为它是在进化上连接脊椎动物和无脊椎动物的最原始的无颌类脊椎动物。同时,它不仅有固有免疫系统,还具有适应性免疫系统。在目前的研究中,对七鳃鳗的免疫系统的研究一直是当今的热点。本研究在七鳃鳗中首次发现了Fyn-like基因,并对Fyn-like基因的cDNA进行了克隆。Fyn-like的ORF区全长1611bp,编码537个氨基酸,3’UTR区1424bp。通过blast序列比对分析发现,它与SRC家族的成员(Yes、Src和Fyn)的同源性都很高。为了说明Fyn-like基因的进化关系,从基因数据库中找出从无颌类到哺乳类动物的Fyn、Yes和Src基因序列进行系谱分析,进一步证实了所克隆得到的基因序列为Fyn-like。目前为止,发现Fyn-like基因从无颌类中首次被发现。对其保守性进行分析,结果表明Fyn-like基因同样包含了三个保守结构域,分别为Src同源结构域3(SH3)、Src同源结构域2(SH2)和激酶结构域(PKc)。通过实时定量PCR和免疫印迹实验分别从基因水平和蛋白水平来检测Fyn-like在七鳃鳗各个组织(白细胞、脂肪体、鳃、肾、心)中的表达,结果发现,用混合菌刺激后,发现在腮组织和白细胞中表达量明显上调,这个结果说明,酪氨酸蛋白激酶Fyn很可能参与免疫应答。免疫荧光实验发现,Fyn-like蛋白主要分布在细胞质中,这可能还与它参与体内多条信号通路、调节细胞的生物学功能相关。我们也分时段检测了鳃组织中免疫后的Fyn-like蛋白的表达情况,结果发现在加强免疫后的16h时,Fyn-like蛋白的表达量最高,随后会逐渐减少。同时,此次研究也可以为之后研究SRC家族激酶之间的进化关系提供必要的基础。
【关键词】：酪氨酸蛋白激酶Fyn-like 进化 日本七鳃鳗 免疫应答
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 绪论9-16
• 1.1 Fyn的发现9
• 1.2 Fyn的结构9-10
• 1.3 Fyn的膜定位方式10-11
• 1.4 Fyn的活化过程11-12
• 1.5 Fyn的主要功能12-15
• 1.5.1 Fyn对神经系统发育中的影响12-13
• 1.5.2 Fyn对T细胞发育的影响13-14
• 1.5.3 Fyn与T细胞受体的相互作用14-15
• 1.6 展望15-16
• 2 日本七鳃鳗Fyn-like基因的分子克隆16-27
• 2.1 材料16
• 2.1.1 实验材料16
• 2.1.2 仪器设备16
• 2.1.3 实验试剂16
• 2.2 方法16-23
• 2.2.1 引物设计16-17
• 2.2.2cDNA模板的制备17-19
• 2.2.3 PCR扩增19-21
• 2.2.4 目的片段切胶回收21
• 2.2.5 末端加A处理21-22
• 2.2.6 目的片段与载体连接22
• 2.2.7 转化22
• 2.2.8 检菌、接菌、质粒提取22-23
• 2.3 结果23-26
• 2.3.1 髓样小体总RNA的提取及模板检验23
• 2.3.2 基因克隆23-26
• 2.4 讨论26
• 2.5 小结26-27
• 3 日本七鳃鳗Fyn-like基因生物信息学的分析27-34
• 3.1 所用到的在线网站及软件27
• 3.2 结果27-33
• 3.2.1 一级结构分析27
• 3.2.2 蛋白质二级结构的预测27-28
• 3.2.3 抗原表位及疏水性的分析28-29
• 3.2.4 同源序列比对29-31
• 3.2.5 系统发育分析31-33
• 3.3 讨论33
• 3.4 小结33-34
• 4 日本七鳃鳗Fyn-like蛋白表达、纯化和抗体的检测34-41
• 4.1 材料与方法34-37
• 4.1.1 引物设计34
• 4.1.2 表达载体的构建34-35
• 4.1.3 阳性重组子的诱导35-36
• 4.1.4 融合蛋白的大量诱导表达36
• 4.1.5 重组蛋白的纯化36-37
• 4.2 结果37-40
• 4.2.1 Lj-Fyn-like表达载体的构建37-39
• 4.2.2 Lj-Fyn-like蛋白的表达、纯化和anti-Yes抗体的检测39-40
• 4.3 讨论40
• 4.4 小结40-41
• 5 Fyn-like在组织中的表达及相关免疫学研究41-55
• 5.1 应用qPCR方法检测日本七鳃鳗Fyn-like基因在成体组织中的表达；41-43
• 5.1.1 材料和方法41
• 5.1.2 结果41-43
• 5.1.3 讨论43
• 5.1.4 小结43
• 5.2 应用免疫印迹技术检测Lj-Fyn-like蛋白在成体组织中的表达43-50
• 5.2.1 材料和方法43-47
• 5.2.2 结果47-49
• 5.2.3 讨论49
• 5.2.4 小结49-50
• 5.3 日本七鳃鳗Fyn-like蛋白在鳃组织和白细胞中的定位与分布50-52
• 5.3.1 材料和方法50
• 5.3.2 结果50-52
• 5.3.3 讨论52
• 5.3.4 小结52
• 5.4 日本七鳃鳗Fyn-like蛋白在鳃组织中的表达时效52-55
• 5.4.1 材料和方法52-53
• 5.4.2 结果53-54
• 5.4.3 讨论54
• 5.4.4 小结54-55
• 6 结论55-56
• 6.1 主要结论55
• 6.2 创新点55-56
• 参考文献56-60
• 附录A 不同物种的Fyn、Yes、Src的FASTA格式氨基酸序列60-69
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况69-70
• 致谢70

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本文编号：766712