绿藻遗传转化体系的优化及转DR5：：GFP小球藻的荧光分析

发布时间：2017-09-01 19:22

  本文关键词：绿藻遗传转化体系的优化及转DR5：：GFP小球藻的荧光分析

  更多相关文章： 转化 单细胞 DR5::GFP 绿藻 生长素

【摘要】：单细胞绿藻是植物分子生物学研究的良好材料,其电击转化因操作简单、成本低等特点倍受研究者的青睐。但传统的藻类电击转化方法中,必须使用较强电场和较长电击时间才能保证外源基因导入细胞内,这带来的负面效果就是增加细胞的致死率从而降低电击转化效率。本研究通过探索不同电击条件转化单细胞绿藻,优化了绿藻转化体系,旨在提高藻类的电击转化效率,为小球藻和莱茵衣藻的进一步利用奠定方法学基础。DR5是生长素诱导的生物活性很强且特异性很高的启动子,结合激光共聚焦显微镜观察,DR5::GFP能够直观且灵敏地反映细胞和组织水平的生长素活性强弱。本研究将DR5::GFP转入到单细胞小球藻中,并对其进行了荧光分析,旨在利用转DR5::GFP绿藻为探针细胞实现单细胞水平IAA测定提供良好的前期基础。主要试验结果如下：(1)建立了绿藻单细胞转化体系,得到了电击最优转化条件。确定了小球藻和莱茵衣藻转化子筛选的潮霉素浓度分别为25 mg/L和100 mg/L,以及小球藻转化子筛选的卡那霉素浓度为100 mg/L。获得了绿藻原生质体电击转化的最佳电场强度,小球藻和莱茵衣藻的原生质体最佳电击场强分别为0.8 KV/cm和0.6 KV/crn。获得了原生质体电击转化最佳脉冲时间,确定小球藻和莱茵衣藻的最佳脉冲时间均为10 ms。发现制备原生质体和2-DG处理能明显提高绿藻电击转化效率。(2)得到了转DR5：：GFP小球藻。通过制备原生质体和2-DG处理并在0.8KV/cm、脉冲时间为10 ms的电击条件下,得到了转DR5::GFP小球藻。(3)获得了适宜诱导GFP表达的IAA浓度。通过不同浓度IAA处理转DR5::GFP小球藻,经激光共聚焦显微镜观察GFP荧光,发现在IAA终浓度为4μg/mL、5μg/mL时其荧光明显。(4)得到了转DR5::GFP小球藻低温保存的较佳条件。通过对不同冷冻温度、不同冷冻保护剂处理的小球藻进行冷冻保存,解冻7天后,结果发现小球藻最优的保存温度为-70℃,冷冻保护剂为10%DMSO+10%蔗糖,其解冻存活率最高,达34.68%。
【关键词】：转化 单细胞 DR5::GFP 绿藻 生长素
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q949.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 第1章 绪论8-12
• 1.1 研究背景8-11
• 1.1.1 生长素测定方法的研究8-9
• 1.1.2 绿藻的分子生物学特性9-10
• 1.1.3 藻类转化方法的研究10-11
• 1.2 研究目的与意义11
• 1.3 研究技术路线11-12
• 第2章 绿藻转化体系的建立12-24
• 2.1 引言12
• 2.2 材料与方法12-18
• 2.2.1 试验材料12-14
• 2.2.2 试验方法14-18
• 2.3 结果与分析18-23
• 2.3.1 绿藻转化中最适潮霉素筛选浓度的确定18-19
• 2.3.2 电击转化中最佳电场强度的确定19-20
• 2.3.3 电击转化中最佳脉冲时间的确定20
• 2.3.4 藻种状态对电击转化的影响20-21
• 2.3.5 转化绿藻分子检测21-22
• 2.3.6 GUS组织化学染色22-23
• 2.4 小结与讨论23-24
• 2.4.1 小球藻和莱茵衣藻遗传转化的筛选条件23
• 2.4.2 影响小球藻和莱茵衣藻转化效率的因素23-24
• 第3章 DR5：：GFP转化小球藻及荧光分析24-32
• 3.1 引言24
• 3.2 材料与方法24-26
• 3.2.1 试验材料24-25
• 3.2.2 试验方法25-26
• 3.3 结果与分析26-30
• 3.3.1 小球藻转化中最适卡那霉素筛选浓度的确定26-27
• 3.3.2 转化藻株的抗性筛选27
• 3.3.3 转化藻株的PCR检测27-28
• 3.3.4 IAA处理转化藻株后荧光检测GFP28-29
• 3.3.5 转化藻株的RT-PCR检测29-30
• 3.4 小结与讨论30-32
• 3.4.1 获得了转DR5：：GFP野生型小球藻30-31
• 3.4.2 获得了适宜诱导GFP表达的IAA浓度31-32
• 第4章 转DR5：：GFP小球藻的低温保存32-38
• 4.1 引言32
• 4.2 材料与方法32-34
• 4.2.1 试验材料32
• 4.2.2 试验方法32-34
• 4.3 结果与分析34-36
• 4.3.1 不同抗冻保护剂对转DR5：：GFP小球藻-20℃冷冻保存的影响34
• 4.3.2 不同抗冻保护剂对转DR5：：GFP小球藻-70℃冷冻保存的影响34-35
• 4.3.3 不同抗冻保护剂对转DR5：：GFP小球藻-196℃冷冻保存的影响35
• 4.3.4 不同冷藏温度对小球藻存活率的影响35-36
• 4.4 小结与讨论36-38
• 4.4.1 不同抗冻保护剂对小球藻低温冷藏的效果36-37
• 4.4.2 不同冷冻温度对小球藻低温冷藏的效果37-38
• 全文总结38-40
• 1 本研究试验结果38
• 1.1 建立了绿藻转化体系38
• 1.2 获得了转化DR5：GFP小球藻及诱导GFP表达的IAA浓度38
• 1.3 得到了转DR5：GFP小球藻的低温保存的较佳条件38
• 2 特色及创新点38-39
• 3 后续研究设想39-40
• 参考文献40-44
• 致谢44-45
• 个人简历45

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本文编号：773946