拟南芥IAA7和TIR1在E.coli和果蝇S2表达系统中的表达

发布时间：2017-09-19 11:17

  本文关键词：拟南芥IAA7和TIR1在E.coli和果蝇S2表达系统中的表达

  更多相关文章： 拟南芥 IAA7 TIR1 重组蛋白 原核表达 真核表达 果蝇S2细胞

【摘要】：植物生长素作为最早被发现的一类植物激素,在植物生长发育的各个阶段都发挥着重要的调节作用。目前,植物生长素的生物合成、运输、降解及信号转导机制方面的研究已经取得了很大进展。其中,生长素受体TIR1和转录抑制因子Aux/IAAs、特别是这两者组成的共受体对生长素具有较高的特异亲和性,这为TIR1和Aux/IAAs在生长素的分离纯化方面的应用提供了启示,为此,获得大量的活性TIR1和Aux/IAAs蛋白是重要基础。因此,本文以野生型拟南芥为材料,通过RT-PCR获得AtIAA7和AtTIRl序列,以带有GST纯化标签的pGEX-KG和pIEx-3载体为基本骨架,构建了原核表达载体pGEX-KG-IAA7、pGEX-KG-TIR1和真核表达载体pIEx-3-IAA7、pIEx-3-TIR1。将原核表达载体分别转化大肠杆菌表达菌株Rosseta(DE3)、BL21(DE3)、Tuner(DE3),优化了重组蛋白的表达和纯化条件。结果表明：GST-IAA7蛋白在Rosset中表达较好,最佳诱导条件为25℃下04 mmol/L的IPTG诱导4h,在此条件下可收获1.6%(鲜重)的重组蛋白；GST-TIR1蛋白则在Ross et菌株中、以0.4 mmol/L浓度的IPTG、于25℃诱导时表达最好,但GST-TIR1重组蛋白以包涵体形式存在。然后,利用GST亲和树脂对GST-IAA7进行纯化,在纯化过程中加入苯甲基磺酰氟(PMSF)可显著增强GST-IAA7重组蛋白在体外的稳定性；最后用凝血酶切除GST标签获得了单一的IAA7蛋白。此外,在建立和优化黑腹果蝇S2胚胎细胞的培养条件基础上,将真核表达载体pIEx-3-IAA7转染S2细胞并筛选稳定表达IAA7的细胞系,结果表明：胎牛血清对S2细胞短期内生长的影响并不大；将pIEx-3-IAA7与筛选质粒pCoHygro共转染S2果蝇胚胎细胞,经潮霉素B筛选,获得能够表达IAA7重组蛋白的稳定细胞系；并用GST亲和树脂从细胞培养液中成功分离和纯化到IAA7重组蛋白。
【关键词】：拟南芥 IAA7 TIR1 重组蛋白 原核表达 真核表达 果蝇S2细胞
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-20
• 1 国内外研究进展10-18
• 1.1 植物生长素及其作用10
• 1.2 生长素检测技术10-12
• 1.3 生长素信号转导12-15
• 1.3.1 生长素信号途径12-13
• 1.3.2 生长素转录抑制蛋白Aux/IAA13
• 1.3.3 生长素受体TIR113-15
• 1.4 重组蛋白表达系统15-18
• 1.4.1 大肠杆菌表达系统15-16
• 1.4.2 昆虫表达系统16-17
• 1.4.3 重组蛋白的纯化17-18
• 2 研究目的和意义18-19
• 3 本研究的总体思路19-20
• 第二章 IAA7和TIR1的原核表达及其分离纯化20-42
• 1 材料与方法20-28
• 1.1 相关材料20
• 1.2 IAA7和TIR1的克隆20-23
• 1.2.1 拟南芥RNA提取及反转录20-21
• 1.2.2 引物设计21-22
• 1.2.3 目的基因获得22-23
• 1.3 重组质粒构建及转化23-27
• 1.3.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备23-24
• 1.3.2 IAA7和TIR1目的基因的T克隆24-26
• 1.3.3 IAA7和TIR1原核表达载体的构建26-27
• 1.4 重组蛋白的诱导表达27
• 1.4.1 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达27
• 1.4.2 重组蛋白原核表达条件的优化27
• 1.5 重组蛋白的分离与纯化27-28
• 2 结果与分析28-39
• 2.1 原核表达载体的构建28-31
• 2.1.1 获得高质量总RNA28-29
• 2.1.2 获得目的基因29-31
• 2.1.3 成功构建IAA7和TIR1的原核表达载体31
• 2.2 重组蛋白的诱导表达及条件优化31-36
• 2.2.1 重组蛋白在不同菌株中的表达31-33
• 2.2.2 诱导温度对重组蛋白表达量的影响33-34
• 2.2.3 诱导剂浓度对重组蛋白表达量的影响34-35
• 2.2.4 重组蛋白的定量35-36
• 2.3 重组蛋白的分离纯化36-38
• 2.3.1 重组蛋白的纯化36-37
• 2.3.2 IAA7蛋白的分离37-38
• 2.4 重组蛋白的稳定性分析38-39
• 3 讨论39-42
• 3.1 重组蛋白的原核表达与纯化39-40
• 3.2 影响重组蛋白稳定性的因素40-42
• 第三章 IAA7和TIR1重组蛋白在昆虫表达系统中的表达42-54
• 1 材料与方法42-47
• 1.1 相关材料42
• 1.2 果蝇S2胚胎细胞的培养42-43
• 1.2.1 培养基及主要缓冲液42
• 1.2.2 S2细胞的复苏42
• 1.2.3 S2细胞的传代培养42-43
• 1.2.4 S2细胞的保存43
• 1.3 重组质粒的构建43-45
• 1.3.1 引物设计43-44
• 1.3.2 目的基因获得44
• 1.3.3 IAA7和TIR1目的基因的T克隆44
• 1.3.4 IAA7和TIR1真核表达载体的构建44-45
• 1.4 重组质粒转染S2细胞,筛选稳定细胞株45-46
• 1.4.1 大量提质粒45
• 1.4.2 重组质粒共转染S2细胞与筛选稳定细胞系45-46
• 1.5 重组蛋白的表达与纯化46-47
• 2 结果与分析47-52
• 2.1 S2果蝇胚胎细胞的培养条件优化47-48
• 2.1.1 培养方式对细胞生长的影响47
• 2.1.2 胎牛血清对细胞生长的影响47-48
• 2.2 重组载体的构建及鉴定48-50
• 2.2.1 获得IAA7和TIR1目的基因48-49
• 2.2.2 成功构建IAA7和TIR1的真核表达载体49-50
• 2.3 获得稳定共转染的IAA7细胞株系50-51
• 2.4 重组蛋白的表达及纯化51-52
• 2.4.1 IAA7重组蛋白的表达与纯化51-52
• 3 讨论52-54
• 3.1 S2果蝇细胞表达系统的优点52-53
• 3.2 影响S2胚胎细胞外源蛋白表达的因素53-54
• 第四章 全文总结及后续研究设想54-56
• 1 全文总结54
• 2 特色及创新54-55
• 3 后续研究设想55-56
• 参考文献56-63
• 致谢63-64
• 作者简介64

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